课件：实验三聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质.ppt

生物化学与分子生物学实验 实验三聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质 掌握盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理 学习盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作技术 了解盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳的应用 实验目的 聚丙烯酰胺凝胶电泳采用不连续系统（即缓冲液成分、pH及凝胶孔径不连续）聚丙烯酰胺凝胶电泳，通过浓缩效应、分子筛效应、电荷效应，将血清中各蛋白质成份依其分子大小、电荷多少不同而进行高效分离。 实验原理 由单体聚丙烯酰胺(Acr)和甲叉双丙烯酰胺(Bis)交联而成的三维网状结构凝胶。 Bis：交联剂 过硫酸铵(AP) ：引发剂，提供自由基， 引发聚合反应 四甲基乙二胺(TEMED)：催化剂, 加快引发 释放自由基的速度 聚丙烯酰胺凝胶（PAG）的聚合反应： 1. 浓缩效应 分离机制： 凝胶层孔径不连续：浓缩胶大孔径，分离胶小孔径 pH值不连续：电泳缓冲液pH=8.3；浓缩胶pH=6.7； 分离胶pH=8.9 缓冲液离子不连续：电泳液中Gly-(慢离子)；凝胶中 Cl-(快离子)；Pr-介于二者之间 电位梯度不连续 成分 pH值 孔径 电泳缓冲液 甘氨酸(慢离子) 8.3 样品 蛋白质 6.7 浓缩胶 Cl-(快离子) 6.7 大 分离胶 Cl-(快离子) 8.9 小 有效迁移率 = 迁移率 ? 解离度 电泳时，氯离子跑得最快，留下一段低电导区，产生高电位梯度（电位与电导率成反比），使甘氨酸离子追赶氯离子，蛋白质夹在中间而被压缩 2.分子筛效应 分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率 3.电荷效应 电荷量不同，迁移率不同。 实验仪器及试剂 电泳装置 稳压电源 盘状电泳槽 毛细滴管 刻度吸量管 灯泡瓶 玻璃管和橡胶帽 微量移液器 注射器和长针头 脱色摇床 TEMED-四甲基乙二胺，避光保存。 过硫酸铵(新鲜配制) 染色液：0.1％溴酚兰液 洗脱液：7％醋酸 其他试剂：见下表贮存液的配制。 Acr和Bis：棕色瓶保存 贮存液 100ml溶液中的含量 pH 工作溶液配制的体积比 1 1N HCl 48.Oml；Tris 36.6克 TEMED 0.23ml 8.9 分离胶制备： 1份1号，2份2号，1份水；抽气后加入4份3号；凝胶浓度 7％；pH= 8.9 2 Acr 28.0克；Bis 0.725克 3 过硫酸铵 0.14克 4 1N HCl 48.Oml；Tris 5.98克 TEMED 0.46ml 6.7 浓缩胶制备： 1份4号，2份5号；抽气后加入4份6号；凝胶浓度 2.5％；pH = 6.7 5 Acr 10.0克；Bis 2.5克 6 蔗糖 40.0克 7 电泳槽缓冲液：Tris 0.60克 甘氨酸 2.88克 8.3 用时可稀释10倍 500ml可供12根电泳管 实验步骤 1. 每人取电泳管1支，加1滴40％蔗糖于橡胶帽内，堵住电泳管底部，塞紧。 2. 制备分离胶： （可灌胶12支） 1号2ml 2号4ml 水2ml 在灯泡瓶中混匀，用真空泵抽气至无气泡； 加3号8ml，混匀备用 最后加 用毛细滴管灌胶于电泳管中至离管口2cm处，然后在距胶面约1cm处，沿玻管壁缓缓加入3-5mm高的水层，垂直静置至再次出现界面时表明凝胶已经聚合。 3. 分离胶的灌制 4. 制备浓缩胶：（可灌胶12支） 4号 1ml 5号 2ml 6号 4ml 在灯泡瓶中混匀，用真空泵抽气至无气泡； 加3号1ml，混匀备用 最后加 5. 吸去分离胶上层的水，灌浓缩胶于分离胶上，高约1.5cm，然后沿管壁小心加入蒸馏水高约0.5cm。垂直放置至成胶。 6. 成胶后，吸干上层覆盖水；拔去玻棒塞，吸去下层蔗糖溶液。将电泳管套在橡皮塞中，装入电泳槽，然后加入下槽缓冲液，排净管底空气。 7. 样品制备 血清：1-2滴 40%蔗糖：1滴 0.05%溴酚兰：1滴 于EP管中混匀备用 倒入上槽缓冲液盖过玻管上端，排出管内的空气，检查有无漏液。用微量加样器吸样品液30ul，加在浓缩胶上。 8. 上样 9. 电泳 上槽——负极；下槽——正极 稳流：1.5mA/管，3min 2