课件：大肠杆菌测定.pptVIP

* * * 大肠菌群的测定 大肠菌群:一群能发酵乳糖,产酸产气,需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌. 分布：分布较广，多存于温血动物粪便，人类粪便中或者被其污染的地方 测量意义：该菌源于粪便,故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量,推断食品中是否有污染肠道致病菌的可能 . 检测方法 国家标准检验方法（乳糖发酵法） 原理：1 一群能发酵乳糖,产酸产气,需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌. 2 大肠菌群在36oC+2oC能在有胆盐存在下生长 MPN:最大可能数的简称.表示样品中活菌的密度.是用概率论来推算样品中菌数近似的数值. 常用的单位: 涂抹大肠实验------MPN/100cm2 液体大肠实验------MPN/100ml 固体大肠实验------MPN/100g 大肠空白没有单位,不用出结果 大肠菌群检验步骤 大肠菌群的检验步骤为检样稀释.依据国标 检样稀释 初发酵(乳糖发酵) 五步 分离培养 证实实验(复发酵) 结果报告 大肠菌群检测流程图 A.检样稀释 1)---以无菌操作将检样25g/ml接种在装有 225ml灭菌生理的盐水或其它稀释液的灭菌玻璃瓶内.充分混合,制成1:10的均匀稀 (2)---用1ml灭菌吸管,吸取1:10稀释液注人含有9ml灭菌生理的盐水或其它稀释液的灭菌试管内,混匀,制成1:100稀释液 无菌取样 样液稀释 充分振摇或研磨 25g或25ml 检样 225mL稀释液 含有玻璃珠的灭菌玻璃瓶或乳钵 1:10稀释液。 1ml 1ml 1ml 9ml水 1:100 9ml水 1:1000 9ml水 1:10000 B.初发酵(通常说的假定试验,目的在于检查样品中有无发酵产气的细菌) 将待检样品接种于乳糖胆发酵管内.接种量在1ml以上者,用双料管,1ml 及1ml以下者,用单料管.每一种稀释液接种3管. 10*0.1 双 料l 双 料 双 料 单 料 单 料 单 料 单 料 单 料 单 料 盐 水 1*0.1 1*0.01 1ml 0.1ml 0.01ml 0.01 0.1 稀 释 液 36±1OC培养箱内.培养24±12h 如发酵都不产气,则报告大肠阴性如发酵有产气进行下步试验 C.分离培养 将产气的样品接种伊红美兰培养基上,36±1OC培养箱内培养,18±24h 观察菌落形态,并做革兰氏染色证实实验 菌落形态:①深紫黑色,具有金属光泽的菌落 ②紫黑色,不代或略带金属光泽的 菌落 ③淡紫黑色,中心色较深的菌落 (可疑菌落)粉红色,中心色无较深的菌落 倒平板 熔化已灭菌的培养基并冷却至45℃左右倒平板，每种培养基每个稀释度各三只平板。 菌落类型 D.证实实验(复发酵) 在上述平板上,挑选典型菌落接种在乳糖发酵管中,置36±1oc培养箱内,培养24±2h,观察产气情况. 凡乳糖产气,革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌,即可报告为大肠菌群阳性. 注意事项 (1).初发酵和证实试验:乳糖发酵实验系样品发酵,不是纯菌的发酵实验,所以初发酵阳性并不代表大肠菌群阳性,因此,必须做进一步证实实验. (2).产气量与倒气管: ① 用于初发酵或复发 酵的导气管内应无气泡, 作空 白对照 ②应以产气为主,产酸仅作参考 ③导气管口被样品颗粒封住,影响结果 3)挑选菌落:在平板呈黑色,有或无金属光泽,检出率最高,粉红色,粉色检出率最低.只挑选一个菌落影响大肠菌群的检出率,当菌落不典型时,应挑选2~3个菌落作证实试验,以免出现假阴性. (4) MPN检索表:本表采用3个稀释度,即1ml(g),0.1ml(g), 0.01ml(g) 若改用10ml(g),1ml(g), 0.1ml(g)时,表内数字应相应降低10倍. 若改用0.1ml(g),0.01ml(g), 0.001ml(g)时,表内数