课件：酶的分子修饰.ppt

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 所谓随机引物是含有各种可能排列顺序的寡核苷酸片段的混合物，它可以与任意核苷酸序列杂交，起到聚合酶反应引物的作用。可用DNaseI降解小牛胸腺DNA获得（6-8个核苷酸）或用人工合成方法获得（6个核苷酸）。 * 然而并非所有的反应底物都可以作为微生物的营养成分，对同一营养物的利用可能有不同的酶（酯酶和脂酶），为了解决这些问题人们设计了各种各样的检测培养基筛选方法 * Reetz等为这一技术的发展作出了杰出的贡献，把红外检测方法用于手性酶的筛选，他们采用德国ThermaCAM SC1000热检测仪来检测脂酶催化乙烯基乙酸脂手性拆分反应中的热量变化，R和S底物被成对的放在孔板中进行单独检测，R底物的催化反应是一个放热反应，成像中表现为“热点”，相反S底物表现为“冷点”，通过对热点的分辨他们的检出了R底物特异性酶[21]。使用先进的红外检测设备和热辐射系数校正技术[22]，可以提高检测的灵敏性，利用时间分辨技术还可以检测手性酶，在微孔板中反应可以很容易的实现高通量筛选。 * * * * * * * * * 静电相互作用（electrostatic interaction）： 又称离子键、盐键、盐桥，是正负电荷间的作用力。对酶分子稳定性有关的盐键大部分形成于分子表面上。 范德华力： 在电中性分子之间的非共价结合。分子间形成的范德华力越大越稳定。 金属离子： Ca2+、Mg2+和Zn2+等高价阳离子与多肽链不稳定的弯曲部分结合，可显著增加酶分子的稳定性。 途径 方法 优点 不足 酶分子改造 核酸水平 蛋白质工程 从根本上提高酶分子稳定性 操作复杂，周期长 蛋白质水平 化学修饰 适应所有酶，操作简单经济 修饰过程破坏酶分子 剂型 固定化 适应所有酶，稳定性高，可重复利用和连续生产 载量较低，易失活 交联酶晶体 稳定性好，载量高，催化效率高 成本高 微环境改良 稳定剂 简单、经济 工作量大 反应介质 适用于特殊反应体系和酶类 适合的酶类还不普遍 2. 稳定酶的方法 附2：酶的活性中心（active site） 一、活性中心的概念 酶的必需基团(essential group): 与酶活性有关的基团 酶的活性中心(active center): 由必需基团构成的与酶催化活性有关的特定区域. 酶分子 非必需基团 必需基团 活性中心 必需基团 活性中心外 必需基团 结合基团 催化基团 非活性中心 活性中心 活性中心的重要化学基团 7种氨基酸出现的频率最高 Lys Asp Glu Cys His Tyr Ser （兰天果拌猪肉丝） 某些功能基团,如（氨基、羧基、巯基、羟基 和咪唑基）是酶的必需基团。 赖氨酸的氨基 天冬氨酸和谷氨酸的羧基 半胱氨酸的巯基 组氨酸的咪唑基 酪氨酸和丝氨酸的羟基 与底物相结合，使底物与酶的一定构象形成复合物 影响底物中某些化学键的稳定，催化底物发生化学反应并将其转化成产物 维持酶活性中心应有空间构象所必需的基团 二、活性中心的共性 (1)活性部位只占酶分子很小的一部分（1-2%）。 (2)活性部位是一个三维实体。 (3)活性中心位于酶分子表面的疏水性裂缝中。 (4)活性中心构象不是固定不变的（诱导契合）。 (5)酶与底物通过盐键、氢键、范德华力和疏水作用等次级键结合。 Active site The active site is the region of the enzyme that binds the substrate, to form an enzyme-substrate complex, and transforms it into product. The active site is a three-dimensional entity, often a cleft or crevice on the surface of the protein, in which the substrate is bound by multiple weak interactions. 三、研究酶活性中心的方法 1.物理学方法： 用X射线衍射法直接检测底物或其类似物与酶形成的中间复合物（包括酶和底物）的相对位置。 2.化学修饰法：根据所用修饰试剂不同，分为 1)非专一性化学修饰 用非专一性的修饰试剂与氨基酸侧链基团作用。 若某基团被修饰后： 酶活性不变——该基团可能不