课件：CH5-2固定化酶的性质.ppt

CH5-2 固定化酶的性质1. 固定化处理对酶性质的影响 从溶液酶的游离状态，到固定化酶的“局限”状态，是一个很大的转变。不仅酶分子本身，而且酶反应的环境也有所不同。因而，固定化酶的性质与溶液酶大相径庭 固定化酶的制备方法很多，酶在固定化过程中，对酶反应系统产生的影响各不相同。我们假定酶固定化之后，在载体表面或多孔介质内的分布完全均匀，我们不考虑固定化处理过程中，技术操作的问题，我们可以将固定化带来影响概括为如下三个方面： ⑴ 构象改变、立体屏蔽 酶在固定化过程中，由于酶和载体之间相互作用，引起酶分子构象发生某种扭曲，从而导致酶与底物的结合能力或催化底物转化能力发生改变，在大多数情况下，固定化致使酶活性不同程度下降。而立体屏蔽是指固定化后，由于载体孔隙太小，或固定化的结合方式不对(如图所示)使酶活性中心或调节部位造成某种空间障碍，使效应物或底物与酶的邻近或接触受到限制。 图 固定化酶的立体屏障效应 活性中心向里 活性中心向外 ⑵ 分配效应和扩散限制 这两种效应都和微环境密切相关。所谓微环境是指紧邻固定化酶的环境区域，主要是载体的疏水亲水及电荷性质带来的影响。 分配效应 是由于载体性质造成的酶的底物或其他效应物在微观环境和宏观体系之间的不等性分配，从而影响酶促反应速度的一种效应。 扩散限制效应 是指底物、产物和其它效应物在环境中的迁移运转速度受到的限制作用。有外扩散限制和内扩散限制两种类型。前者是指物质从宏观体系穿过包围在固定化酶颗粒周围近乎停滞的液膜层(又称Nernsl层)达到颗粒表面时所受到的限制。内扩散限制是指上述物质进一步向颗粒内部酶所在点扩散所受到的限制。 ⑶ 微扰 由于载体的亲水、疏水作用和介质的介电常数等性质，直接影响酶的催化能力或酶对效应物作出反应的能力，这种效应称为微扰。目前还不能作定量描述。实际上构象改变，立体屏蔽效应，也还不能作定量描述。近年来，关于蛋白质“可及表面”计算方法的进展，似为这几种效应的定量讨论，展示了一种前景。以上效应将具体表现在酶的动力学性质、酶的稳定性、酶促反应影响因素、乃至酶的底物专一性等方面。 CH5-2 固定化酶的性质2. 固定化的酶性质 ⑴ 分配效应对Km的影响 这种影响通常用分配系数(ρ)来描述： ρ＝[Si]／[S] (1) 式中[Si]和[S]分别表示底物或其它效应物在微环境中的局部浓度和宏观体系中的总体(或平均)浓度。 对最简单的固定化酶系统而言，其动力学性态，一般仍服从米氏方程。当反应系统进行充分搅拌，消除外扩散限制影响时，只考虑分配效应的影响，则反应速度可表示如下： ? Vmax[Si] v= (2) Km+[Si] ? Vmax[S] ρ = (3) Km+[S] ρ ? Vmax[S] Vmax[S] = = (4) Km/ρ+[S] K’m+[S] ? [K’m= Km/ρ] (5) 这表明分配系数的影响，是改变了Km。K’m是分配效应影响下的表观米氏常数。由式(1)和(5)，可以看出[Si]＜[S]，则ρ＜1， K’m＞Km，表明固定化作用降低酶对底物的亲和力。 通过载体和底物电荷性质、离子强度和pH值对分配效应的影响讨论，可以得出一般性规律如下： ① 载体与底物带相同电荷时，相斥，[Si]＜[S]，K’m＞Km。 ② 当载体带正电荷时，局部H+ 浓度低于总体浓度，[Si]变大，K’变小，即酶活力一pH曲线向酸性方向偏移，亦即最适pH向酸性方向偏移；反之，离子载体将向碱性方向偏移，如图所示。 1. 载体带正电荷， 最适pH向偏酸性偏移； 2. 游离酶的最适pH 3.载体带负电荷， 最适pH向偏碱方向偏移； V ③ 上述效应，通过提高反应系统的离子强度，可以减弱或消除。当离子强度等于载体电荷基团浓度一半时，K’m＝Km／2，当离子强度远大于载体电荷基团浓度时，K’m＝Km。 ④ 采用疏水性载体时，如底物为极性物质或电荷性物质，则[Si]小，K’m＞Km；如底物为疏水性物 CH5-2 固定化酶的性质2. 固定化的酶性质 ⑵ 扩散限制效应 酶固定化之后，由于扩散限制，使得酶往往不能得到宏观体系相同水平的底物，因而观测到的实效反应速度