课件：血清学实验技术.pptVIP

* * * * 对流免疫电泳 ①Ag为阳性；②Ag为弱阳性；③Ag为强阳性；④Ag为强阳性 三、免疫标记技术 抗原与抗体结合了，但复合物小，不能通过凝集或沉淀用肉眼观察到。 定义： 将抗原-抗体反应与标记技术相结合，用放射性同位素、酶或荧光素标记的已知抗体或抗原，通过检测标记物，间接测定未知的抗原或抗体。 检测标记物的存在，间接反映抗原抗体发生了结合。 抗原抗体反应的特异性 标记分子的敏感性 分类： 放射免疫测定法：131I，32P 免疫荧光技术：FITC，PE 免疫酶测定法：HRP，AP 免疫酶测定法(Enzyme ImmunoAssay,EIA) 用酶标记的抗原或抗体进行的抗原抗体反应。 辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶(AP) 特点： 高度特异性：保持抗原抗体反应的特异性 高灵敏度：酶催化底物显色的高效性，pg水平微量检测 定性定量检测：反应液颜色深浅或光密度值 分类： 酶联免疫吸附试验：可溶性抗原或抗体 酶免疫组化法： 组织中或细胞表面的抗原。 酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA) 用酶标记抗原或抗体检测液体（血液、细胞液）中未知抗体或抗原的方法。 1.定义 2.分类 间接法（Indirect ELISA）： 将已知抗原吸附于固相载体，酶标记二抗 检测液相中未知抗体 双抗体夹心法（Sandwich ELISA)： 将已知抗体吸附于固相载体，酶标记一抗 检测液相中的可溶性抗原 竞争法（Competitive ELISA) ： 将已知抗体或抗原吸附于固相载体，酶标记抗原或抗体 检测液相中的可溶性抗原或抗体 酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA) 3. 原理（以间接性ELISA为例）： 显色 四、补体结合反应 补体结合反应： 是指在补体的参与下，以绵羊红细胞（SRBC）和溶血素（抗SRBC的抗体）作为指示系统的抗原抗体反应。 补反中包括两个系统五种成分： 待检系统：已知Ag或Ab、待检Ab或Ag 补体:仅供一组Ag-Ab系统反应的定量补体。 指示系统：绵羊红细胞和溶血素。 原理： 待测系统 抗原+未知血清 1 2 补体 1 2 Step 1 抗原抗体复合物的形成 Step 2 补体的结合和耗竭 指示系统 SRBC+抗SRBC抗体 Step 3 SRBC的裂解 1 2 1：No Ab； 2：Ab Ag 待测血清 Ab 阳性 No Ab 阴性 Ag Ag Ag 五、中和试验 　 病毒或毒素与相应的抗体结合，抗体中和了病毒或毒素，失去了对易感动物的致病力，这种试验称为中和试验。 Western Blot （参考） Diagram 通过电泳区分不同的组分，并转移至固相支持物，通过特异性试剂（抗体）作为探针，对靶物质进行检测。 蛋白质的Western印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种特点，可检测到低至1～5ng（最低可到10－100pg）中等大小的靶蛋白 原理 二抗孵育 蛋白提取与定量 一抗孵育 封闭 转膜 SDS-聚丙烯酰胺电泳 蛋白变性 显影 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 作用 缓冲液PH 凝胶浓度 浓缩胶 使蛋白样品浓缩 PH6.8Tris-Cl 低，2-5% 分离胶 使蛋白样品分离 PH8.8Tris-Cl 高，根据蛋白大小 电泳缓冲液：PH8.3Tris-甘氨酸-SDS系统。 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 灌制分离胶 隔绝空气 灌好后一般室温放置30－40分钟 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 灌制积层胶 插入梳子 上样及电泳 提前将样品沸水浴5分钟，13000rpm离心10分钟。 根据自己的设计上样。 80V恒压跑浓缩胶。 看溴酚蓝压缩成一条线后把电压调为100V。 当溴酚蓝跑至离胶的下面还有0.4－0.6mm时停止电泳。 转膜 蛋白质带负电荷，凝胶在负极一侧，膜在正极一侧，接通电源以后，蛋白质由负极向正极转移至膜上。 膜的封闭 为避免膜与作为检测试剂的特异性第一抗体发生非特异性结合，使非特异性背景提高，需对膜上的潜在结合位点进行封闭处理,一般用5％的脱脂奶粉或者3％的BSA室温或37度封闭2小时。 转好蛋白的膜 Protein Protein 封闭 Protein Protein Blocking Agent Blocking Agent Blocking Agent 一抗孵育 Protein Protein Blocking Agent Blocking Agent Blocking Agent