纸层析法分离氨基酸.ppt

纸层析法分离氨基酸 实验目的 1、掌握分配层析的原理，学习氨基酸纸层析法的操作技术 (包括点样、平衡、展层、显色、鉴定及定量)。 2、学习未知样品的氨基酸成分(水解、层析及鉴定)分析的方法。 实验原理 层析法又叫色层分离法、色谱分析法或色谱法。 1944年应用滤纸作为固定支持物的“纸层析”诞生以来，层析技术的发展越来越快，五十年代开始，相继出现了气相色谱和高压液相层析，其它如薄层层析、亲合层析、凝胶层析等也迅猛发展。层析分离技术操作简便，样品用量可大可小，既可用于实验室分离分析，又适用于工业生产中产品的分析制备。现已成为生物化学、分子生物学、生物工程等学科广泛应用而又必不可少的分析工具之一。 分配层析 分配层析法是利用不同的物质在两个互不相溶的溶剂中的分配情况不同而使之得到分离的方法。 分配层析法中不同溶质的分离取决于其在两相 (固定相和流动相)间分配系数的不同。 分配系数(K)的定义是： K=溶质在固定相的浓度(CS)/溶质在流动相的浓度(CL) 实验材料与试剂 实验试剂 1、氨基酸标准液(1mg/mL) 五种氨基酸是丙氨酸、甘氨酸、谷氨酸,脯氨酸分别配制成一定浓度的溶液。 2、展开剂是：正丁醇：甲酸：水=15:3:2 (正丁醇：水：乙酸=4：1：1) 3、0.2%茚三酮丙酮溶液。 4、氨基酸混合液(每种氨基酸500mg/mL)。 实验器材: 1、滤纸。 2、培养皿(直径115mm)。 3、电热鼓风干燥箱。 4、喷雾器及吹风机。 5、点样管及点样架。 6、针、线、尺。 7、烧杯(50mL)。 实验操作 （一）、标准氨基酸纸上层析 1、单向上行层析 (1)、氨基酸Rf值的测定 A、滤纸：选用国产滤纸，10cm×20cm，在距纸边2cm处，用铅笔轻轻划一条线，于线上每隔2cm处画一小圆圈作为点样处，圈直径不超过0.3cm。 B、点样：点样要合适，样品点的太浓，斑点易扩散或拉长，以致分离不清，氨基酸的点样量以每种氨基酸含 5～20μg为宜，用点样管(也可用血色素管代替)吸取氨基酸样品10μg(1μg/μL)，与滤纸垂直方向轻轻碰触点样处的中心，这时样品就自动流出。点样的扩散直径控制在0.3cm之内，点样过程中必须在第一滴样品干后再点第二滴，为使样品加速干燥，可用一加热装置(如吹风机)，但要注意温度不可过高，以免氨基酸破坏，特别是谷氨酰胺破坏，影响定量结果。 将点好样品的滤纸两侧比齐，用线缝好，揉成筒状。注意缝线处纸的两边不要接触。避免由于毛细管现象使溶剂沿两边移动特别快而造成溶剂前沿不齐，影响Rf值。 C、展层：将揉成圆筒状的滤纸放入培养皿内 (注意滤纸不要碰皿壁)，当溶剂展层至距离纸的上沿约1cm时，取出滤纸，立即用铅笔标出溶剂前沿位置，晾干，使纸上溶剂自然挥发，直至除净溶剂。 酸溶剂系统：正丁醇： 80%甲酸：水=15:3:2(体积比)，茚三酮5ml。温度25℃，时间1h。 注意：使用的溶剂系统需新鲜配制，并要摇匀。展层溶剂每张约需25mL。 D、显色：待展层基本结束后, ，置65℃鼓风箱中10-20min，鼓风保温，滤纸上即显出紫红色/黄色斑点。 E、Rf值的计算：用尺测量显色斑点的中心与原点(点样中心)之间的距离和原点到溶剂前沿的距离，求出此值，即得氨基酸的Rf值。 计算出 5种氨基酸在酸系统中的Rf值。 大家需要带的物品 1、直尺 2、针线（白线） 3、实验报告纸（完成实验报告） 4、电吹风 5、口罩 注意 使用茚三酮显色法，必须在整个层析操作中避免手直接接触层析纸，因为手上常常有少量含氮物质。显色时它也呈现紫色斑点。污染了层析结果，因此操作时应戴橡皮手套或指套。同时也要防止空气中的氨。 * * 二、纸层析 (一) 原理 纸上层析实际上是以滤纸纤维的结合水为固定相，而以有机溶剂(与水不相混溶或部分混溶)作为流动相。展开时，有机溶剂在滤纸上流动，样品中各物质在两相之间不断地进行分配。由于各物质有不同的分配系数，移动速度因此不同，从而达到分离的目的。 溶质在滤纸上移动的速率可用Rf值表示： Rf= X/ Y 式中X：溶质斑点中心的移动距离 Y：溶剂前沿移动的距离 Rf值决定于分配系数。 不同物质的分配系数不同，Rf值也不相同，由此可以根据Rf值的大小对物质进行定性分析。 (二) 影响Rf值的主要因素