乳糖操纵子DNA域lacO→乳糖阻遏蛋白LacIpUC192686bp.ppt

短肽配基 分离提纯质粒DNA 研究意义 质粒性质 质粒合成与分离 色谱法分离提纯 色谱法分离提纯 色谱法分离提纯 研究现状——多肽配基设计 研究现状——多肽配基设计 研究现状——多肽配基设计 47mer，27mer，16mer和14mer的KD分别为8.8±1.3×10-10M，7.2±0.6×10-10M， 4.5±0.5×10-8M，6.2±0.9×10-6M 3号螺旋虽然能增强结合力，但由于其空间位阻反使KD值降低 16mer缩氨酸特异性测试（pUC19和pEGFP-N1） 研究现状——多肽配基设计 研究目标 研究思路 pDNA与蛋白配基特异性结合位点分析 以该位点氨基酸序列为根据，设计可能的短肽配基 通过分子模拟，筛选出高亲和性的配基 通过实验验证该配基的实际效益 通过实验寻找配基的最佳吸附洗脱条件 特色与创新 分子模拟为配基筛选提供动力学支持，大幅减少配基筛选过程的实验量 提供一种设计独有的短肽配基新思路 相对于多肽配基，短肽配基合成成本降低，更具经济效益 研究计划和拟解决的问题 选择合适的蛋白配基结合位点，进行仿生设计 筛选出具有实际利用价值的短肽配基 优化色谱流程的条件 * * 报告人 屠依龙 报告时间 2012.8.13 基因疗法，DNA药物的广泛应用 病毒的不安全性 质粒的优势： 使用安全 易于转染 生产简易 分子量大于106，远远大于蛋白 芳香基的紧密填充双螺旋内部为高度失水 大肠杆菌自主复制 最终p DNA（g DNA ≤0.05，宿主蛋白无 法测得，RNA无法测得，内毒素≤ 0.1） 碱性溶解（pH≤12.5） 超速离心 溶剂萃取 亲和色谱 蛋白配基 氨基酸 色素 过渡金属离子 短肽 结构简单，选择性不高 具有一定选择性，理化性好，成本低 氨基酸 （组氨酸，赖氨酸，精氨酸） 成本高，容量小，稳定性差 高亲和性 蛋白质 （酶抑制剂，抗体，辅酶） 选择性低 成本低 过渡金属离子 选择性低 有毒 承受较苛刻洗脱条件 色素 超速离心 溶剂萃取 亲和色谱 蛋白配基 氨基酸 色素 过渡金属离子 短肽 原理：乳糖操纵子DNA域（lacO）→乳糖阻遏蛋白（LacI） pUC19（2686bp）中lacO1（180-196），lacO3（88-104） LacI为DNA结合蛋白，结合域包括螺旋Ⅰ（6-12），转角，螺旋Ⅱ（17-25），螺旋Ⅲ（32-45），螺旋Ⅳ（50-58）。其中螺旋Ⅰ和螺旋Ⅱ形成HTH结构。 LacI几乎不与RNA反应，固定化后依然具有生物活性 存在问题 1.目前依然处于多肽配基研究的早期阶段 2.多肽配基的合成成本高昂 3.亲合作用复杂，配基的寻找困难 设计寻找短肽配基，特异性结合sc质粒DNA * * *