(参考)基因工程--第六章--DNA重组的操作.pptVIP

* 二、重组DNA导入真核细胞的方法 常用的方法有电击法、磷酸钙沉淀法、脂质体介导法等； 进入细胞的DNA可以被整合至宿主细胞的基因组中，也可以在染色体外存在和表达。 * （一）重组DNA导入酵母菌细胞 许多酵母菌菌株都可用作基因克隆或表达的受体菌，其转化一般有以下几种方法： 原生质体转化法 碱金属离子介导的酵母菌完整细胞的转化 PEG1000转化法 电击法 * （二）重组DNA导入植物细胞 植物基因转化方法可分为3大类 载体介导的转化方法 DNA直接导入法 种质系统法，包括花粉管通道法、生殖细胞浸泡法和胚囊子房注射法。 其中载体介导的转化方法是目前植物基因工程中使用最多、机制最清楚、技术最成熟的一种转化方法，而转化载体中又以Ti质粒转化载体最为重要。 * （三）重组DNA导入动物细胞 磷酸钙沉淀法 脂质体介导感染法 显微注射法 病毒感染法 DEAE葡聚糖转染技术 电击法 血影细胞介导法 * 转化率是指每μg载体DNA在最佳转化条件下进入受体细胞的分子数，是衡量转化效率的重要指标。 在一般实验规模下，每个受体细胞最多只能接受一个载体分子 转化率的定义也可以表述为：每微克载体DNA转化后，受体细胞接纳DNA的个数，即阳性克隆数。 三、转化率及其影响因素 * （一）转化率的计算 转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率及感受态细胞转化效率，公式如下： 转化子总数＝菌落数×转化反应原液总体积／涂板菌液体积 转化（频）率（转化子数／每mg质粒DNA）＝转化子总数／质粒DNA加入量 感受态细胞总数＝对照组的菌落数×菌液总体积／涂板菌液体积 * （二）转化率的用途 利用转化率和重组率等参数可以帮助设计DNA重组实验规模 例如：某一DNA重组实验的重组率为20%，转化率为107/mg载体，经酶切和连接处理后的重组载体转化率比天然载体约低100倍，欲获得104个重组克隆，需投入多少载体DNA进行重组实验？ 当重组率为100%，则转化后产生104个重组克隆需要104/（107×10-2） = 0.1 mg 载体DNA 。 所以当重组率为20%，所以实际投入载体应为： 0.1 / 20% = 0.5 mg 载体DNA。 载体投入量确定后，外源DNA的投入量即可按10︰1的要求算出（5 mg），甚至还可以估算需要涂布多少块平板进行筛选。 * （三）转化率的影响因素 转化率的影响因素很多，可从载体DNA及目标DNA重组、受体细胞和转化手段三个方面进行考虑。 载体DNA及目标DNA重组 受体细胞 转化手段 * 重组体导入受体细胞以后，经过短时间的培养扩增即可用于进一步的筛选与鉴定。 所谓的筛选鉴定是指通过特定的方法，从被转化的细胞群体或基因文库中，鉴别出真正具有重组DNA分子的阳性克隆（重组子）的过程。 第三节 重组子的筛选与鉴定 * DNA测序 检测方法 PCR 载体表型 插入基因表型 DNA电泳 免疫化学 核酸杂交 * 一、载体表型选择法 pBR322质粒编码有四环素抗性基因（Tetr）和氨苄青霉素抗性基因（Ampr）； Tetr上插入位点：BamH I和Sal I; Ampr上插入位点Pst I。 （一）抗药性标记插入失活选择法 * 带有pBR322质粒的宿主细胞能在含有四环素或氨苄青霉素的培养基中生长，表现出amprtetr的表型； 检测外源DNA插入的一种方法是插入失活效应（insertional inactivation）。 在pBR322质粒的tetr和ampr基因内均有REase的单一识别位点可供外源DNA的插入，这些位点中任何一个一旦有外源DNA的插入，都会导致tetr或ampr基因出现功能性失活，于是形成的重组体转化子将具有amprtets或ampstetr的表型。 * 抗药性标记插入失活选择法 * ?-半乳糖苷酶 乳糖 半乳糖 葡萄糖 Xgal 半乳糖 5-溴-4-氯靛蓝 + 深蓝色 + （二）β-半乳糖苷酶显色反应选择法 ?-peptide C-terminus of b-galactosiase a -互补作用 X-ga+IPTG+Amp X-ga+IPTG+Amp * β-半乳糖苷酶显色反应选择法 * 重组位点attB 、 a