液体乳中三聚氰胺的快速检测胶体金免疫层析法.DOCVIP

——PAGE \* MERGEFORMAT18— —PAGE \* MERGEFORMAT1—— 附件7 液体乳中三聚氰胺的快速检测 胶体金免疫层析法 （征求意见稿） 范围 本方法规定了液体乳中三聚氰胺的胶体金免疫层析快速检测方法。 本方法适用于巴氏杀菌乳、灭菌乳、调制乳和发酵乳中三聚氰胺的快速测定。 原理 本方法采用竞争抑制免疫层析原理。样品中的三聚氰胺与胶体金标记的特异性抗体结合，抑制抗体和试纸条或检测卡中检测线（T线）上抗原的结合，从而导致检测线颜色深浅的变化。通过检测线与控制线（C线）颜色深浅比较，对样品中三聚氰胺进行定性判定。 试剂和材料 除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的二级水。 试剂 3.1.1 甲醇。 3.1.2 三羟甲基氨基甲烷（Tris）。 3.1.3 1mol/L盐酸：移取79.36mL浓盐酸，加水100mL水中，定容至1L。 3.1.4 甲醇水溶液：准确量取50 mL甲醇和50 mL水，混匀后备用。 3.1.5 稀释液：准确称取6.05 g Tris（3.1.2）和8.5 g 1 mol/L盐酸（3.1.3），加水定容至1 L，混匀后备用。 参考物质 参考物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子质量见表1，纯度≥99%。 表1 三聚氰胺参考物质中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子质量 中文名称 英文名称 CAS登录号 分子式 相对分子质量 三聚氰胺 Melamine 108-78-1 C3H6N6 126.12 注：或等同可溯源物质。 标准溶液的配制 三聚氰胺标准储备液（1 mg/mL）：精密称取三聚氰胺标准品（3.2）适量，置于10 mL容量瓶中，用甲醇水溶液（3.1.4）溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为1 mg/mL的三聚氰胺标准储备液；或可直接购三聚氰胺标准储备液。4℃避光保存备用，有效期3个月。 材料 三聚氰胺胶体金免疫层析试剂盒：适用基质为液体乳。 金标微孔（含胶体金标记的特异性抗体）。 试纸条或检测卡。 仪器和设备 移液器：200 μL、1000 μL和5 mL。 涡旋混合器。 电子天平：感量为 0.01 g。 环境条件：温度15—35℃，湿度≤80%。 分析步骤 试样制备 取适量有代表性样品充分混匀。 试样提取 准确称取样品0.5 g于离心管中，加入5 mL稀释液（3.1.5），涡旋混匀提取5 min，即得待测液。 测定步骤 试纸条与金标微孔测定步骤 吸取150—200 μL样品待测液于金标微孔（3.4.1）中，抽吸5~10次使混合均匀，不要有气泡，40℃温育3 min，将检测试纸条（3.4.2）样品端垂直向下插入金标微孔中，40℃温育5 min，从微孔中取出试纸条，进行结果判定。 检测卡测定步骤 吸取150—200 μL样品待测液于检测卡加样孔（3.4.2）中，室温反应3~5 min，进行结果判定。 质控试验 每批样品应同时进行空白试验和加标质控试验。 空白试验 称取空白试样，按照5.2和5.3步骤与样品同法操作。 加标质控试验 准确称取空白试样100 g（精确至0.01 g）置于100 mL玻璃溶液瓶中，加入250 μL三聚氰胺标准溶液（1?mg/mL）（3.3.1），使试样中三聚氰胺浓度为2.5 mg/kg，按照5.2和5.3步骤与样品同法操作。 结果判定要求 通过对比控制线（C线）和检测线（T线）的颜色深浅进行结果判定。目视结果判读如图1。 无效 控制线（C线）不显色，表明不正确操作或试纸条/检测卡无效。 阳性结果 消线法 检测线（T线）不显色，控制线（C线）显色，表明样品中三聚氰胺含量高于方法检测限，判定为阳性。 比色法 检测线（T线）颜色比控制线（C线）颜色浅或几乎不显色，表明样品中三聚氰胺含量高于方法检测限，判定为阳性。 阴性结果 消线法 检测线（T线）、控制线（C线）均显色，表明样品中三聚氰胺含量低于方法检测限，判定为阴性。 比色法 检测线（T线）颜色比控制线（C线）颜色深或者检测线（T线）颜色与控制线（C线）颜色相当，表明样品中三聚氰胺含量低于方法检测限，判定为阴性。 图1试纸条/检测卡目视判定示意图 质控试验要求 空白试验测定结果应为阴性，加标质控试验测定结果应为阳性。 结论 三聚氰胺与灭蝇胺有交叉反应，当检测结果为阳性时，应对三聚氰胺结果进行确证。 性能指标 检测限：2.5mg/kg。 灵敏度：灵敏度应≥99% 特异性：特异性应≥85%。 假阴性率：假阴性率应≤1%。 假阳性率：假阳性率应≤15%。 注：性能指标计算方法参见附录A。 其他 本方法所述试剂、试剂盒信息及操作步骤是为给方法使用者提供方便，在使用本方法时不做限定，可根据试剂盒说明书进行操作。方法使用者应使用经过验证的满足本方