双向凝胶电泳.ppt

IEF的基本条件 Stemp 1 Stemp 2 Stemp 3 total voltage Time Volt-Hours Ramp 250 20min －－－ Linear 4000 4000 2hr －－－ －－－ 10,000V-hr Linear Rapid 5 hr 14,000V-hr 7 cm Stemp 1 Stemp 2 Stemp 3 total total Stemp 1 Stemp 2 Stemp 3 11 cm 17 cm 250 250 8000 10000 10000 8000 20min 20min 2.5hr 2.5hr －－－ －－－ －－－ －－－ －－－ －－－ 20,000V-hr 40,000V-hr ～30,000V-hr ～50,000V-hr 5.3 hr 7 hr Linear Linear Linear Linear Rapid Rapid 第五章 双向凝胶电泳(2D) 蛋白质组分析的技术路线 双向凝胶电泳技术的发展及原理 仪器简介 样品制备 技术流程 1. 蛋白质组分析的技术路线 要求 流程 技术路线 蛋白质组分析的首要要求 　　将来自于全细胞、组织或生物体中所包含的多达几千种混合蛋白质进行分离、检测和分析 。 生物学问题的提出 实验模型的设计 实验组和对照组样品的制备 蛋白样品的IEF和PAGE电泳分离 图像扫描和初步分析 感兴趣蛋白点的切取 胰酶对脱色后蛋白质的消化 质谱的多肽指纹图、微测序分析 质谱结果的生物信息学分析和比对 新蛋白质的发现 其它实验的进一步验证 蛋白信息的初步获得 蛋 白 质 组 分 析 流 程 蛋白质组研究的基本技术路线 蛋白质样品的制备 双向电泳 图像分析 转印至膜上的蛋白 凝胶中的蛋白 溶液中的蛋白 混合肽 蛋白质质量 N端测序 肽序列质谱数据 肽指纹图 数据搜索 新的或已知蛋白 蛋白转录后修饰的鉴定 2. 双向电泳技术的发展及原理 双向凝胶电泳的发展 双向凝胶电泳的基本原理 双向凝胶电泳的发展 　　双向凝胶电泳的思路最早是由Smithies 和Poulik提出 (Smithies O, Poulik MD. Two-dimensional electrophoresis of serum proteins. Nature, 1956, 177: 1033)，蛋白质第一向电泳是根据其自由溶液迁移率 (free-solution mobility)，在滤纸条上进行；第二向电泳方向与第一向垂直，在淀粉胶上进行。 　　随后，Raymond发明了聚丙烯酰胺凝胶电泳 (Raymond S, Weintraub L. Acrylamide gel as a supporting medium for zone electrophoresis. Science, 1959, 30:711)，双向电泳的支持介质逐渐转向聚丙烯酰胺凝胶 (Margolis J, Kenrick KG. Two-dimensional resolution of plasma proteins by combination of polyac-rylamide disc and gradient gel electrophoresis. Nature, 1969, 221: 1056-1057)，这即是双向凝胶电泳 (two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis, 2D PAGE)。 　　同年，2D PAGE在原理上又有了新的发展，以第一向为蛋白质等电聚焦的双向凝胶电泳技术建立起来，即IEF(Dale G, Latner AL. Isoelectric focusing of serum proteins in acrylamide gels followed by electrophoresis. Clin Chim Acta, 1969, 24: 61-68；Macko V, Stegemann H. Mapping of potato proteins by combined elctrofocusing and electrophoresis identification of varieties. Hoppe-seyler’s Z Physiol. Chem, 1969, 350: 917-919)。 　　20世纪70年代初，在第二向电泳中又使用了十二烷基磺酸钠 (SDS) (Barrett T, Gould HJ. Tissue and species specificity of non-histone chromatin proteins. Biochim Biophys Acta, 1973,