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KLK14在宫颈癌组织中表达和其意义 【摘要】目的探讨KLK14蛋白宫颈癌中的表达 及与临床病理关系。方法应用免疫组织化学法SP检测10 例正常宫颈14例慢性宫颈炎48宫颈癌组织中KLK14蛋白的 表达。应用半定量逆转录聚合酶链反应法RTPCR检测25例 宫颈鳞癌及10例正常宫颈组织中KLK14 mRNA的表达。结果 KLK14蛋白在48例宫颈癌中阳性率729%,正常宫颈20%,慢 性宫颈炎143%,三者相比差异有统计学意义，KLK14蛋白阳 性率与肿瘤临床分期，病理学相关（P005）。KLK14 mRNA在 宫颈癌相对表达量高于正常宫颈组织。结论KLK14表达参与 宫颈癌的发生发展。 【关键词】宫颈鳞癌；人激肽释放酶14；逆转录聚合 酶链反应 基金项目：河南省卫生厅课题项目（项目编号：2008046） 作者单位：450052郑州大学第五附属医院宫颈癌是妇 科常见的恶性肿瘤之一，疗效总体生存率不高，经常地进行 评估是必须的，激肽释放酶（kallikrein, KLK）家族是目 前被研究与恶性肿瘤表达相关的基因家族，参与体内多种 生理病理过程oKLK14是KLK家族中一员，拟采用SP及RTPCR 研究宫颈癌细胞内KLK14蛋白及mRNA的表达，探讨其在宫 颈癌中发生发展意义及与临床病理的关系。 1资料与方法 11 一般资料48例宫颈癌取自2007年1月至2010年1 月我院手术切除标本，正常宫颈10例，慢性宫颈炎14例来 源于同期子宫切除术标本，所有标本部分存于8(TC冰箱中用 RNA提取，另一部分用福尔马林固定石蜡包埋进行SP检测。 患者年龄29?71岁，中位年龄435岁。宫颈癌病理：鳞状 细胞癌43例，腺癌5例，分期：I期21例，II期13例， III期9例，IV期5例。分级：G112例，G220例，G3 16例。 淋巴转移者17例，无淋巴转移者31例。所有患者均为初发 者，术前均未接受过放化疗治疗。同期取正常宫颈组织10 例和25例宫颈鳞癌行RTPCR实验。 12主要试剂山羊抗人KLK14多克隆抗体(Santn Cruz 公司)和SP9003三步法试剂盒(兔抗羊，北京中杉公司) Trizol试剂购自invitrogen公司，AMV逆转录试剂盒 (AMV3500)购自promega公司。ExTaq酶试剂盒购自大连宝 生物公司。KLK14及3actin引物由上海生工生物有限公司 合成。RTPCR仪器为biorid公司产品。 13方法 131 SP法所有组织标本固定石蜡包埋，4 nm厚连续 切片，每批染色均设阴性和阳性对照。阴性对照采用磷酸盐 缓冲液(PBS)代替一抗，阳性对照取已知KLK蛋白表达阳 性的乳腺癌组织的石蜡切片。 132 RTPCR法采用Trizol -步法提取组织总RNA,取1 Pg总RNA,用AMV逆转录试剂盒进行反转录获得cDNA （逆 转录反应参照试剂盒说明进行），取2 u g cDNA为模板进行 PCR 反应，KLK14 上游引物序列为 5CCGCAGACTTCACCACTCG TAT3,下游引物序列为 5AGGTGTGAGGCAGGCGIAAF3,用 B actin 作为内参照，上游引物为5TGGCAGGACTTCA GA3,下游引物 5AGTGGCTAGAAGTTCACC3, ［1］。PCR 反应条件为：95°C预变性 4 min, 95°C变性 30 sec, 56°C退火 30 sec, 72°C延伸 30 sec, 35个循环后最后72匸延伸5 min,所有的反应体系均做2管, 作为平行对照。在实验过程中，每次结束均将PCR产物进行 1%琼脂糖凝胶电泳，检测扩增产物长度。紫外分光光度计检 测RNA纯度及浓度。 14阳性结果判定标准免疫组织化学参照文献［2］制 订。KLK14蛋白定位细胞浆，显示胞浆为淡黄色或棕黄色者 为阳性细胞，凡显色强度与背景无明显差异者为阴性，而显 色强度高于背景为阳性表达，将阳性细胞按其数量及显色强 度分为3级，表达阳性细胞数小于10%,染色强度为弱阳性 或仅个别细胞呈中至强阳性染色，即为表达弱阳性（ + ）;阳 性细胞为60%以上，多数细胞呈黄色或棕黄色染色，即表达 强阳性+++；表达的阳性细胞数及强度介于上述二者之间为 阳性（++）。 15统计学方法采用SPSS 110统计软件。各计量资料 比较应用t检验（经正态性检验和方差齐性检验），KLK14表 达与临床参数关系采用x2检验，P KLK14是KLK家族 中一员，全长6439bp,有三联体残基表明KLK14具有胰蛋白 酶活性，翻译分泌性蛋白[4]。KLK14基因及蛋白与妇科肿 瘤，消化道肿瘤，乳腺癌，肺癌等疾病发生发展有重要关系 ⑷。 32 KLK14基因及蛋白在不同宫颈组织的表达意义本实 验研究了 KLK14蛋白在