人GCSF-白蛋白融合蛋白构建及在毕赤酵母中表达.pdf

药物生物技术 Pharmaceutical 2008，15(2)：109～114 109 Biotechnology 人GCSF一白蛋白融合蛋白的构建及在毕赤酵母中的表达’ 徐 钰1，孙钧铭2，张莲芬1，窦文芳1，李洁1，朱 威1，朱书峰1，金 坚1* (1．江南大学生物工程学院生物制药系、工业生物技术教育部重点实验室， 江苏无锡214122；2．无锡第三人民医院中心实验室，江苏无锡214041) 摘要制备人粒细胞集落刺激因子(DCSF)与人血清白蛋白(HSA)的融合蛋白。从新鲜人外周血中分 离单核细胞，给予大肠杆菌脂多糖刺激后，RT-PCR制备G-CSFcDNA，以其为模板扩增得到人G-CSF的编码区 277 序列(525bp)。重叠PCR拼接HSA-GCsF融合基因(2bp)，序列测定正确，中间未加入任何连接肽。插人 赤酵母菌KM71，G418筛选得到高拷贝转化子。甲醇诱导表达融合蛋白，SD孓PAGE鉴定融合蛋白的相对分子 质量约为84k，Western 蛋白具有G-CSF的生物学活性。结果：构建了可分泌表达HSA-GCSF融合蛋白的毕赤酵母工程菌，为进一步 对其进行药学研究奠定了基础。 关键词人粒细胞集落刺激因子；人血清白蛋白；融合蛋白；毕赤酵母 中图分类号：S642．5；Q81文献标识码；A 文章编号：1005—8915(2008)02-0109一06 人粒细胞集落刺激因子(granulocytecolony-的药物生物利用度、降低给药剂量，减少临床治疗疗 factor，GCSF)是一种来源于单核细胞程的给药次数和患者的经济负担。 stimulating 和纤维组织母细胞的长链多肽糖蛋白，相对分子质 1材料和方法 量17．9～21．8k[1|。基础和临床研究已证实G CSF有专一性地刺激粒细胞的增殖分化，减轻化 1．1材料 疗后白细胞减少，促进白细胞再生，增强机体杀伤 1．1．1 质粒、茵株和细胞株 毕赤酵母Pichia 癌细胞的效果[2’3]，但天然的或基因重组的G-CSFpastoris 在体内的半衰期只有1．3～4．2h[4|，且持续给药会 引发药疹、发热、肌痛、骨痛等副作用[5]，因此开发 肠杆菌E．coliDH5a、含有HSA编码基因的质粒 lI KS(+)由 G-CSF的长效制剂十分必要。 pBIue-HSA和克隆载体pBluescript seruIrl 人血清白蛋白(Humanalbumin，HSA)分本室保存[61。 子质量相对较大，血浆半衰期在20d左右[6]，在体内 1．1．2工具酶与试剂 脂多糖(LPS)购自美国 存在着血管内和血管外组织间隙的动态平衡，主要起 Sigma公司，Trizol购自上海华舜生物，真核表达 维持血浆渗透压、作为内源l生和外源性物质载体等作 I，Not 用，可作为药物的天然储存库，达到对药物的缓慢释 DNA聚合酶pfu、dNTP、限制内切酶EcoR I、T4 放，是一种比较理想的融合蛋白载体[7]。本研究将 DNA连接酶、酵母抽提物、蛋白胨、酵母氮 HSA与G-CSF进行无连接肽的融合，构建HSA-基YNB均购自上海生工生物工程服务有限公司， GCSF融合蛋白的毕赤酵母表达工程菌，期望该融合尿微量蛋白检测试剂盒购自上海名典生物工程有 蛋白既能保持G-CSF的生物活性，又能改善G-CSF限公司，HSA多克隆抗体购自成都生物制品所，其 收稿日期：2007—03—21修回日期：200