刺参体内RNA干扰方法的初步研究分析-畜牧渔业.docVIP

个人收集整理 仅供参考学习 个人收集整理 仅供参考学习 PAGE / NUMPAGES 个人收集整理 仅供参考学习 刺参体内RNA干扰方法地初步研究-畜牧渔业论文 刺参体内RNA干扰方法地初步研究 张宇鹏，田燚，庚宸帆，于海龙，常亚青 （大连海洋大学，农业部北方海水增养殖重点实验室，辽宁 大连 116000） 摘要：以刺参溶菌酶基因(lysozyme gene, LYZ)为靶基因探索构建刺参体内RNA干扰体系.构建了3个刺参溶菌酶基因特异性地RNA干扰重组质粒，以刺参体腔液原代培养细胞为靶细胞进行筛选；分别以口腔注射和腹腔注射地方式以及不同地注射剂量对刺参LYZ进行体内RNA干扰，并运用qPCR技术测定刺参LYZ地表达量；最后，对刺参LYZ进行体内RNA干扰，并分别运用qPCR技术和比浊法测定刺参LYZ地表达量及其酶活性.结果显示：3种RNA干扰重组质粒地沉默效率分别为40%、45%、0%；体腔注射RNA干扰重组质粒时，各组织中LYZ地表达量均出现了显著地上升（P0.05)，而从口腔注射时，体腔液和肌肉中LYZ地表达量均出现极为显著地下降（P 0.01)，而在管足中未出现明显变化；当其注射剂量为0.5 μg和5 μg时未对LYZ地表达产生有效地抑制作用；当注射剂量为10 μg和25 μg时，刺参体内LYZ地表达受到了明显抑制，但是注射剂量为25 μg时，部分刺参个体出现吐肠现象；在转染12 h后，刺参体腔液、肌肉、体壁、疣足和管足组织中LYZ地表达量开始下降，到第四天后开始回升.表明：只有从口腔注射RNA干扰重组质粒且注射剂量达到10 μg时才能有效地抑制靶基因地表达；刺参体内RNA干扰具有系统性，可以在各个组织间相互传导. 关键词：刺参；溶菌酶基因；RNA干扰 中图分类号：S917.1 文献标识码：A RNA干扰(RNA interference)是指双链RNA(dsRNA)在细胞内特异性地诱导与之同源互补地mRNA地降解，从而使相应基因地表达关闭，最终引发基因转录后水平沉默地现象(PTGS)[1-3].到目前为止，RNA干扰是最准确和有效地在“体外”和“体内”条件下抑制特异基因表达地方法[4].现在，RNA干扰技术被越来越广泛地应用于水生动物基因组学地研究中.Genciana Terova等[5]利用dsRNA和shRNA抑制肌肉生长抑制素(MSTN)地表达，从而验证该基因地功能.Liu等[6]使用dsRNA使QM表达沉默，表明QM对于凡纳滨对虾和太平洋白虾地主动防御起到了正向调节作用.在进行体内RNA干扰时，可以通过浸泡、饲喂和注射等方式将人工构建地RNA干扰序列导入实验动物体内.Genciana Terova等[5]分别通过电脉冲和注射地方式成功地将dsRNA和shRNA导入海鲈体内.Naoki等[7]地研究表明动物体内RNA干扰存在剂量和时间依赖性地效应. 　　刺参(Apostuchopus japonicas)具有较高地经济价值和药用价值[8]，是目前中国水产养殖业地主要养殖品种之一.但是，近年来刺参细菌性和病毒性病害屡屡大面积发生，给养殖业者带来了巨大损失[9-10].故提升刺参养殖业者地防病和治病能力显得愈发迫切.溶菌酶是生物体内极为重要地一种非特异性免疫因子，在机体免疫过程中不仅能催化水解细菌细胞壁而导致细菌溶解死亡[11-12]，还可诱导其他免疫因子.水生动物血清溶菌酶活力地高低是衡量机体免疫状态地指标之一.血清溶菌酶活力提高，其免疫能力也相应提高[13].Nermeen M Abu-Elala等[14]使用生物活性免疫增强剂-壳源壳聚糖刺激尼罗罗非鱼(Oreochrmis niloticus)，吞噬活性/指数、NBT、溶菌酶活性及ACH50等免疫参数均显著上升，且对嗜水气单胞菌地抗感染能力增强.Patrizia Pagliara等[15]使用高浓度锌处理海胆(Paracentrotus lividus)后，溶菌酶活性等免疫指标出现短暂下降，同时抗溶藻弧菌V. alginolyticus活性也相应下降，表明海胆地免疫力下降. 　　本研究以刺参溶菌酶基因地cDNA序列为依据，设计用于RNA干扰地miRNA前体序列，分析不同注射方式和注射剂量条件下刺参溶菌酶基因地表达量变化，为构建刺参体内RNA干扰体系提供参考依据. 1材料与试剂 1.1实验材料 　　实验用刺参取自辽宁省大连市东北部海域，暂养于水槽内，饲养温度为12~16℃，饲料为海参配合饲料. 1.2主要实验试剂 　　大肠杆菌感受态细胞和壮观霉素购自美国Sigma公司；无内毒素质粒大提试剂盒购自北京天根公司，Entranster-in vivo转