细菌内毒素检测技术及应用.ppt

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * D、加样及反应；  1、0.1mlBET水 空白 溶液C 溶液A 溶液B 2、0.1ml自各溶液 37度反应1h E、结果判断；  1、只有当溶液A（检测样品稀释液）、D空白（检测用水）为阴性；溶液C（2λ内毒素溶液）为阳性，试验有效； 2、溶液B（含2 λ内毒素的样品溶液）系列中，第一个出现阳性结果的浓度即初步将其判断为样品的无干扰浓度； 4、干扰试验 1）目的及原理 A、通过比较鲎试剂与内毒素在水溶液和供试品溶液中反应的差异程度，来确定供试品在该浓度下是否对BET检查有干扰； B、至少对3批样品进行干扰试验。  1）实验步骤 A、供试品限值的确定（略）； B、鲎试剂的选择（略）； C、最大有效稀释倍数的确定； D、反应溶液的制备； E、加样及反应； F、结果判断。  B、鲎试剂的选择； a、根据干扰初筛试验的结果，供试品在20倍稀释时无干扰； b、一般不选择第一个出现阳性结果的供试品浓度作干扰实验。 C、最大有效稀释倍数的确定； 根据上述干扰预实验结果，我们选择灵敏度为0.25EU/ml的鲎试剂，则MVD=40倍。  D、各反应溶液的制备； E、加样及反应；（略） F、结果判断：  计算：ES=antilg{[(log0.25)*4]/4} =10-0.602=0.25EU/ml ∈[0.125,0.5] Et=antilg{[(log0.25)*3+ (log0.125)]/4} =10-0.67725=0.21EU/ml ∈[0.125,0.5] 只有当Et在[0.5ES,2ES]范围内时,检测样品对鲎试剂无干扰；该稀释倍数可以用于日常检测； 5、检查法  * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 2、最大有效稀释倍数（MVD） --供试品MVD按下式计算：MVD=cL/λ A.C为供试品浓度，其中当L以EU/ml表示时，c为1.0ml/ml； B.M为内毒素限值； C.λ为鲎试剂的灵敏度（凝胶法）或标准曲线最低点浓度（光度法）。  例子：如果使用鲎试剂灵敏度为0.25EU/ml，注射用头孢曲松钠舒巴坦钠（浓度为10mg/ml，L=0.2EU/mg）的最大有效稀释倍数为：  3、最低有效浓度（MVC） MVC=λ/L A. λ为鲎试剂的灵敏度（凝胶法）或标准曲线最低点浓度（光度法）； B.L为内毒素限值；  例子：如果用鲎试剂灵敏度为0.25EU/ml，注射用头孢曲松钠舒巴坦钠的最低有效浓度为：  4、样品稀释过程中加液量的计算 稀释过程中，假设从溶液S1取（X）ml溶液稀释（n）倍至S2，加液量为（y）,则满足 Y=（n-1）* x 例子：如从溶液S1取0.5ml稀释3.8倍至S2,则加液量为： Y=（3.8-1）* 0.5=1.4（ml）,即0.5ml的S1加1.4ml稀释液即得S1的3.8倍稀释液S2。  5、计算 A、2010版药典：紫杉醇注射液细菌内毒素检查： 取本品，加内毒素检查用水稀释制成每1ml中含紫杉醇0.15mg或更低浓度，依法检查每1mg紫杉醇中含内毒素的量应小于0.40EU，问应该选用灵敏度为多少的鲎试剂来做检测？？  解答： λ=MVC*L=MVC*0.4EU/mg 药典要求：MVC ≤0.15mg/ml， 则选用鲎试剂灵敏度 λ ≤0.15mg/ml*0.4EU/mg=0.06EU/ml  B、注射用头孢哌酮钠舒巴坦钠细菌内毒素： 取本品，用内毒素检查用水制成每1ml中含0.6mg的溶液，依法检查，每1mg本品中含内毒素的量应小于0.050EU，问应该选用灵敏度为多少的鲎试剂来做检测？？  解答： λ=MVC*L=MVC*0.050EU/mg 药典要求：MVC =0.6mg/ml， 则选用鲎试剂灵敏度 λ =0.6mg/ml*0.050EU/mg=0.03EU/ml  五、凝胶法细菌内毒素检查技术 1、凝胶法BET试验程序 2、试验器具 3、鲎试剂灵