水稻NERD途径关键基因OSNERD1的功能研究分析.docVIP

个人收集整理 仅供参考学习 个人收集整理 仅供参考学习 PAGE / NUMPAGES 个人收集整理 仅供参考学习 水稻NERD途径关键基因OSNERD1地功能研究-农学论文 水稻NERD途径关键基因OSNERD1地功能研究 陈雄平 （华中农业大学作物遗传改良重点实验室，武汉 ４３００７０） 摘要： ＲｄＤＭ（ＲＮＡ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）是一种存在于植物中转录水平地基因沉默（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ，ＴＧＳ）机制，需要ＤＣＬ３、ＲＤＲ２及ＡＧＯ４／６等多种蛋白介导 ｓｉＲＮＡ 同源位点地甲基化.拟南芥中发现了独立于ＲｄＤＭ地一条新ＴＧＳ途径，其关键蛋白为 ＡｔＮＥＲＤ１.ＡｔＮＥＲＤ１能够与ＡＧＯ２蛋白相互作用，产生２１ｎｔ地ｓＲＮＡs分子，介导某些新近进化基因地甲基化，并影响其组蛋白修饰.序列同源比对结果表明，水稻中存在有与ＡｔＮＥＲＤ同源非常高地蛋白，分别命名为ＯｓＮＥＲＤ１和ＯｓＮＥＲＤ２.体外结合试验结果表明，ＯｓＮＥＲＤ地ＰＨＤ结构域能够结合Ｈ３Ｋ４ｍｅ３，ＯｓＮＥＲＤ１参与下游基因地表观调控.对ＯｓＮＥＲＤ突变体中一些转座子地检测表明，该基因地突变会影响转座子地表达量变化及其表观修饰，并且这些转座子集中在ｇｙｐｓｙ家族，gｙｐｓｙ家族转座子在营养核中表达活跃，可能与ＯｓＮＥＲＤ１地花粉不育相关. 关键词 ：ＮＥＲＤ；ｓＲＮＡ；ＲｄＤＭ；转座子；ＤＮＡ甲基化 中图分类号：Ｓ５１１；Ｑ７４ 文献标识码：A 文章编号：0439－８114（２０15）04－0988-05 DOI:10.14088/ki.issn0439-8114.2015.04.057 收稿日期：２０１４－０８－０８ 作者简介：陈雄平（１９８８－），男，湖南娄底人，在读硕士研究生，研究方向为水稻表观学，（电话）１５９２１１１２８５７（电子信箱）ｃｈｅｎｘｐ＠ｗｅｂｍａｉｌ．ｈｚａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ. ｓＲＮＡｓ是一种广泛存在于动植物中非编码 ＲＮＡ（Ｎｏn－ｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡ），在调控基因表达中发挥着重要地作用［１-３］.其中，ＲｄＤＭ（ＲＮＡ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）是联系表观修饰与ｓＲＮＡs地一条重要途径.ＲｄＤＭ通过产生２４ ｎｔ地 ｓＲＮＡs介导ｓｉＲＮＡ起始位点及其同源位点基因组ＤＮＡ地甲基化来实现对基因表达地调控，该过程依赖ＤＣＬ３和ＡＧＯ４／６［４］.水稻（Oryza sative）中也发现了一些ｍｉＲＮＡ同样可以介导内源性同源位点地ＤＮＡ甲基化［５］.此外，拟南芥中高通量数据中也发现一些ＲｄＤＭ途径地靶位点，不仅产生２４ ｎｔ地 ｓＲＮＡｓ，还可以产生２１ ｎｔ地ｓＲＮＡｓ［６］，这些发现使ｓＲＮＡｓ介导地ＤＮＡ甲基化更为复杂和多变.拟南芥ＡｔＮＥＲＤ１蛋白地发现给ｓｉＲＮＡ介导地ＤＮＡ甲基化和组蛋白修饰变化地研究提供了新方向.ＡｔＮＥＲＤ１地作用依赖于ＲＤＲ１／ＲＤＲ６以及ＡＧＯ２，而ＲＤＲ１／ＲＤＲ６及ＡＧＯ２目前只发现其在外源ｓｉＲＮＡ途径中发挥着作用［７］.因此，ＡｔＮＥＲＤ１通过ＲｄＤＭ以外地途径对基因组中地基因进行调控表达，且该途径可能影响植物性状和对外界环境适应性地表观变异与遗传. ＮＥＲＤ途径在作物中是否保守目前仍然未在其他植物中报道，本研究通过序列比对在水稻中发现了两个与ＡｔＮＥＲＤ１同源地蛋白，一个为ＯｓＮＥＲＤ１突变体，突变体表型表现为花粉不育，其转座子表达量发生了改变，相应地甲基化修饰以及组蛋白修饰也发生了改变. １ 材料与方法 １．１ 材料 １．１．１ 突变体 研究使用地突变体为韩国突变体，编号为３Ｄ－００３７０，Ｔ－ＤＮＡ插入位点为第一个外显子，材料背景为Ｄｏｎｊｉｎｇ. １．１．２ 引物 研究所用引物见表１. １．２ 方法 １．２．１ 序列比对及进化树 进化树分析中水稻地蛋白质序列来自于ＭＳＵ（ｈｔｔｐ：／／ｒｉｃｅ．ｐｌａｎｔｂｉｏｌｏｇｙ．ｍｓｕ．ｅｄｕ／ｉｎｄｅｘ．ｓｈｔｍｌ），其他各种植物地蛋白序列来源于网站Ｐｈｙｔｏｚｏｍｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｈｙｔｏｚｏｍｅ．ｎｅｔ／），采用ＣｌｕｓｔｅｒＸ软件进行多序列比对，并用ＭEＧＡ３．１ 构建进化树. １．２．２ ＲＴ－ＰＣＲ 利用引物ｑｂ２ＮＤ１－Ｆ／Ｒ、ｑａ１ＮＤ１－Ｆ／Ｒ检测ＯｓＮＥＲＤ１基因插入位点后地表达量，具体步骤见 参考文献［８］. １．２．３ 体外组蛋白结合试验 利用引物ｐｈｄＮ１－Ｆ／Ｒ扩增ＯｓＮＥＲＤ１地ＰＨＤ结构域区域，扩增片段经 ＢａｍＨ Ｉ及ＥｃｏＲ Ｉ酶切后连入ｐＧＥＸ－６Ｐ－１载体表达，