基因工程的原理技术73705.ppt

农杆菌特点：生活在土壤中，能够在自然条件下感染 双子叶植物和裸子植物，受植物体伤口处的细胞分泌的大量酚类化合物的吸引，农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。 1）将目的基因导入植物细胞 a.农杆菌转化法（采用最多的方法） 原理：将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上，通过农杆菌转化，使目的基因进入植物细胞，并将其插入到植物细胞染色体的DNA上。使目的基因的遗传特性得以稳定的维持和表达。 优点及应用：此法比较经济和有效，约80%的转基因植物都是通过这种方法获得。 我国科学家独创的一种方法 实例：我国的转基因抗虫棉 （1）常用于单子叶植物 的基因转化 （2）缺点：成本较高 基因枪法 花粉管通道法 2）将目的基因导入动物细胞 提纯基因表达载体 体外显微注射入受精卵 经胚胎早期培养后 移植到雌性体内 受体细胞： 显微注射技术 基本操作程序： 原因是：受精卵全能性较高，可使外源基因在相应的组织细胞内表达。 受精卵 最常用的方法: 1）早期基因工程为什么选用原核生物作为受体细胞？ 原核生物繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少 2）应用最为广泛的受体细胞是大肠杆菌 3）方法： 3）将目的基因导入微生物细胞 a.用Ca2+处理细胞（以增加细菌细胞壁的通透性），使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，这种细胞称为感受态细胞； b.是将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。 思考4:利用大肠杆菌能生产人的糖蛋白吗? 有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链,这些糖链是在内质网和高尔基体上加工完成.大肠杆菌是原核生物,不存在这两种细胞器,因此在大肠杆菌生产这种糖蛋白是不可能的. 1.将目的基因导入植物细胞 农杆菌转化法 基因枪法 2.将目的基因导入动物细胞 显微注射技术（最多、最有效） 3.将目的基因导入微生物细胞 Ca2+处理 花粉管通道法 小结 基因工程操作步骤的必要性 ①目的基因的获取； ②表达载体的构建； ③将目的基因导入受体细胞； ④目的基因的检测与鉴定。 因为并不是所有受体细胞的DNA都接纳了目的基因、也并不是所有插入的目的基因都能正确表达，因此需要 筛选。只有通过检测和鉴定，才能得知目的基因是否 能够在受体细胞中稳定存在和正确表达。 温故知新 为什么要有这一步 第四步：目的基因的检测和鉴定 ①检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因 ——DNA分子杂交 DNA分子杂交技术 【小组交流】阅读教材14页，讨论什么是DNA分子探针？ 检测时探针通过什么原理来检测目的基因？ 探针是一小段单链DNA或者RNA片段（约20到500bp），用于检测与其互补的核酸序列。 根据重组质粒上目的基因的部分DNA序列，人工合成（或PCR技术合成）与之互补的一小段单链DNA（或RNA) ,利用带有32P-磷酸的dATP使其标记上放射性同位素，这一小段与目的基因的部分序列互补的核酸分子称为DNA探针。 什么是DNA分子探针？ DNA分子杂交技术 互补碱基序列的DNA分子，可以通过碱基对之间形成氢键等，形成稳定的双链区。 DNA分子杂交的双方是所使用的探针和要检测的核酸 DNA分子杂交的理论基础是： 基因探针与目的基因杂交，观察标记有无杂交带 将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交 不能，受体细胞必须合成相应的蛋白质或表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了表达。 受体细胞摄入DNA分子后就说明目的基因完成了表达吗？ 若不能表达，要对抗虫基因再进行修饰。 第四步：目的基因的检测和鉴定 ①检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因 ②检测目的基因是否转录出了mRNA ③检测目的基因是否翻译成蛋白质 ——DNA分子杂交 ——分子杂交 ——抗原—抗体杂交 分子水平检测 抗原—抗体杂交 从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原——抗体杂交，若有杂交带出现，表明目的基因已形成蛋白质产品。 以上检测是分子水平，有时还需进行个体生物学水平的鉴定，如对植物的抗虫抗病特性的鉴定等。 第四步：目的基因的检测和鉴定 ①检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因 ②检测目的基因是否转录出了mRNA ③检测目的基因是否翻译成蛋白质 ④是否赋予个体新的遗传特性 ——DNA分子杂交 ——分子杂交 ——抗原—抗体杂交 分子水平检测 个体 水平 鉴定 基因工程的基本操作程序 1、目的基因的获取 2、形成重组DNA分子； 3、将目的基因导入受体细胞 4、筛选含有目的基因的受体细胞、 目的基因表达 1、从基因文库中获取目的基因 2、利用PCR技术扩增