多壁碳纳米管的血液相容性实验的原理.docVIP

第四章 多壁碳纳米管的血液相容性实验的原理、方法、以及结果分析 对于任何一种准备用于人体的生物材料来讲，材料的生物相容性是首先必须考虑的问题。；生物材料如果比较成功，至少要使发生的反应被宿主接受，不产生有害作用，因此要对生物材料进行生物安全性评价，即生物学评价。那么碳纳米管材料是否具有优良的生物相容性呢？我们做了几项血液相容性测试，从而反映了其生物相容性。 4.1 实验所用试剂及仪器 1. 试剂 名称 备注 生产厂家 白蛋白(Alb) Sigma 纤维蛋白原(Fib) Sigma 免疫球蛋白(IgG) Sigma 草酸钾 天津市瑞金特化学品有限公司 磷酸盐缓冲液（PBS） 北京中杉金桥生物技术有限公司 乙二胺四乙酸 Sigma 甲基硅油 Sigma 2. 仪器与耗材 CO2恒温培养箱 ThermoForma 自动双重纯水蒸馏器 上海亚荣生化仪器厂 数显恒温水浴锅 金坛市荣华仪器制造有限公司 电热恒温鼓风干燥箱 上海精宏设备公司 微量天平 Nmettler Toledo LD5-2A型低速离心机 北京医用离心机厂 722分光光度计 上海第三分析仪器厂 Nicolet 5700红外光谱仪（Omni-采样器） 美国Thermo-Fisher公司 液氮罐 成都金凤液氮容器公司 1000ml正压不锈钢滤器 上海医药工业研究院 一次性滤器（0.2μm） Life Sciences 细胞计数板 天津北海玻璃仪器公司 细胞计数器 国产 25cm2一次性培养瓶 Corning 一次性培养板（24孔） Costar 一次性培养板（96孔） Costar 4.2 蛋白吸附实验 材料表面和血液接触后立即在材料表面吸附一层蛋白质，这一蛋白质吸附层是表面血栓形成的重要因素。蛋白吸附层的成份组成影响血小板在表面的黏附，激活和释放反应。许多研究表明纤维蛋白原、纤维连接蛋白原与球蛋白在表面的吸附能促进血小板在表面的黏附，易形成血栓；而白蛋白在表面的吸附，不促进血小板在表面的黏附，不易形成血栓。因此材料表面纤维蛋白原的吸附在血栓形成中起重要作用。 4.2.1 蛋白质溶液的配置 （1）取1ml、100mg/ml的白蛋白(Alb)溶液，加入4mlPBS缓冲液，配置成5ml终浓度为20mg/ml的Alb溶液； （2） 取3.09ml、32.4mg/ml的免疫球蛋白(IgG)溶液，加入1.81mlPBS缓冲液，配置成5ml终浓度为20mg/ml的IgG溶液； （3） 称取100mg纤维蛋白原(Fib)冻干粉，溶解到5mlPBS缓冲液中，配置成5ml终浓度为20mg/ml的Fib溶液。 4.2.2 实验步骤 （1） 取碳纸组、碳纳米管组材料各9片，每片0.5cm×0.5cm大小，在材料上方滴加300μl的20mg/ml的蛋白质溶液，每种蛋白质各3片，如图4.1所示； Alb Alb Fib IgG 碳纸组 碳纳米管组 图4.1 研究蛋白质吸附时样品使用示意图 （2） 在37℃ （3）将样品固定在Omni采样器上，启动程序，设定参数扫描间隔为4cm-1，扫描为次数为32，扫描范围为650-4000cm-1 （4） 以未吸附蛋白质的空白材料为参考光谱，对吸附有蛋白质的材料进行扫描，利用Nicolet 5700红外光谱仪（美国Thermo公司），如图4.2所示获得材料表面吸附蛋白质的红外光谱； （5） 对获得的红外光谱实验结果进行分析和处理。 图4.2 Nicolet 5700红外光谱仪 4.2.3 实验结果分析 蛋白质的红外光谱有多个特征吸收峰，氨基II带（中心峰1550 cm-1）的强度与材料表面吸附的蛋白质量呈线性关系[66]。图4.3为材料表面吸附蛋白质的红外光谱图。其中图A、C、E为碳纸表面吸附蛋白质的红外光谱，图B、D、F为多壁碳纳米管表面吸附蛋白质的红外光谱（1450-1750 cm-1）。根据碳纸和碳纳米管表面吸附蛋白质的红外光谱及根文献[67]中的方法计算得到蛋白质吸附量结果及两种材料表面的RA/F 和RA/I值列于表4.1中。 A. 碳纸表面吸附Alb的红外图谱 B. 碳纳米管表面吸附Alb的红外图谱 C. 碳纸表面吸附Fib的红外图谱 D. 碳纳米管表面吸附Fib的红外图谱 E. 碳纸表面吸附IgG的红外图谱 F. 碳纳米管表面吸附IgG的红外图谱 图 4.3 材料表面吸附蛋白质的红外光谱 表 4.1 红外实验数据结果 材料 蛋白 C MWCNTs Alb 0.00520 0.00520 Fib 0.000977 0.00893 IgG RA/F RA/I 0.00407 5.322