线粒体膜势能的检测DNA片断化检测大分子染色体DNA片段DNA.PPT

* * 细 胞 凋 亡 检 测 细 胞 凋 亡 概 念 是多细胞有机体为维护内环境稳定，由基因控制的细 胞自主、有序的死亡过程 涉及一系列基因的激活、表达和调控 在生物体进化、维持内环境稳定、多系统发育等过程 中起着重要作用 细 胞 凋 亡 过 程 细胞凋亡的几种检测方法 形态学观察：普通光镜、荧光显微镜、透射电子显微镜 磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法） 线粒体膜势能的检测 DNA片断化检测：大分子染色体DNA片段、 DNA Ladder 脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法 （terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL） 半胱氨酸蛋白酶Caspase家族活性的检测 形态学观察 光学显微镜和倒置显微镜：体积缩小、核深染、核碎裂、 凋亡小体形成、无炎症反应 荧光显微镜和激光共聚焦显微镜： DNA特异性染料 （ Hoechest 33342/33258, DAPI） 透射电子显微镜：超微结构是诊断凋亡的最可靠指标 Annexin V法 磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine，PS）：细胞凋亡早期从内侧翻转到细胞膜表面 Annexin V:钙依赖性的磷脂结合蛋白，与PS可高亲和力特异性结合 Annexin V 与 PI联合 碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。 已开发出多种荧光标记的试剂盒 流式细胞仪分析 荧光显微镜结果 线 粒 体 膜 势 能 检 测 线粒体跨膜电位DYmt的下降，被认为是细胞凋亡级联 反应过程中较早发生的事件，它发生在细胞核凋亡特征 （染色质浓缩、DNA断裂）出现之前 亲脂性阳离子荧光染料（如Rhodamine 123、Dioc6、JC- 1、TMRM等）可结合到线粒体基质，流式细胞仪检测 细胞的荧光强度 不能区分细胞凋亡或其他原因导致的线粒体膜电位的变 化 DNA 片 断 化 检 测 细胞凋亡时主要的生化特征是其染色质发生浓缩, 染色质DNA在核小体单位之间的连接处断裂, 形成50~300kb长的DNA大片段, 或180~200bp整数倍的寡核苷酸片段, 在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱(DNA ladder)。 TUNEL 细胞凋亡中, 染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大 量的粘性3’-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶 （TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化 物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的 3’-末端，从而可进行凋亡细胞的检测 是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单 个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确地反应 细胞凋亡典型的生物化学和形态特征 Caspase活性的检测 在正常状态下， Caspase家族都以无活性的酶原(30～ 50kD)形式表达，当细胞发生凋亡时Caspase可以被蛋白酶 裂解，大亚基和小亚基形成活化的Caspase 。一些Caspase 活化后可以次序激活其他Caspase形成Caspase级联反应， 促发细胞凋亡。在目前已知的14种Caspase中， Caspase- 3、Caspase-8和Caspase-9与凋亡的关系最为密切，在细 胞凋亡中起执行凋亡的作用。 *