代谢工程改造Gluconobactersuboxydans生产酮基-D-生物通.PDF

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１４，３４（１２）：９７１０６ ＤＯＩ：１０．１３５２３／ｊ．ｃｂ 代谢工程改造Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒｓｕｂｏｘｙｄａｎｓ 生产２酮基Ｄ葡萄糖酸 ２ １ ３ １ １ １ 仪修南 　李天明 　王北辰 　刘金雷 　杜红燕 　冯惠勇 （１河北科技大学　石家庄　０５００１８　２山东大学　济南　２５０１００　３西北农林科技大学　杨凌　７１２１００） 摘要　２酮基Ｄ葡萄糖酸是重要的抗氧化剂和食品添加剂———Ｄ异抗坏血酸的重要前体。弱氧 化葡糖酸杆菌（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒｓｕｂｏｘｙｄａｎｓ）具有丰富的周质空间氧化还原酶类，可将葡萄糖氧化为 葡萄糖酸再氧化为２酮基Ｄ葡萄糖酸。以提高２酮基Ｄ葡萄糖酸的产量和减少副产物为目标， 采用同源重组染色体修饰策略，将编码甘油脱氢酶的基因ｇｌｄｈ置换为编码葡萄糖脱氢酶的基因 ｇｄｈ，将编码山梨醇脱氢酶的基因ｓｄｈ置换为编码２酮Ｄ葡萄糖酸脱氢酶的基因ｇａ２ｄｈ。经 ＰＣＲ、酶活性显色及发酵产物ＨＰＬＣ检测验证表明：构建的工程菌株ｇｄｈ和ｇａ２ｄｈ基因被强化而 ｇｌｄｈ和ｓｄｈ被敲除；使用１０％的葡萄糖复合培养基，摇瓶发酵７２ｈ，工程菌２ＫＧＡ３发酵液中没有 副产物５酮基葡萄糖酸，２酮基Ｄ葡萄糖酸的含量终浓度达到７２．３ｇ／Ｌ，比野生菌株提高４２．２ ｇ／Ｌ，工程菌和野生菌的２ＤＫＧＡ质量转化率分别为７２．３％和３０．１％，工程菌比野生菌提高１．４ 倍。构建获得的工程菌，不需要外加抗生素，可以保持稳定遗传，对于工业化规模生产具有一定 优势，为获得可产业化显示的优势遗传资源打下了基础。 关键词　２酮基Ｄ葡萄糖酸　弱氧化葡萄糖酸杆菌　葡萄糖氧化酶　２酮Ｄ葡萄糖酸脱氢酶 中图分类号　Ｑ７８９ ［１１］ ［１２］ 　　２酮基Ｄ葡萄糖酸（２ｋｅｔｏＤＧｌｕｃｏｎｉｃＡｃｉｄ，２Ｄ 文氏菌属 、沙雷氏菌属 、葡萄糖酸杆菌属和醋酸 ＫＧＡ）是Ｄ异抗坏血酸合成过程中的重要前体，也是除 ［１３］ 杆菌属等 。目前，实现产业化生产的菌种是荧光假 草剂、Ｄ酮糖、Ｄ阿拉伯糖合成的重要前体，可作为食 单胞菌，在含有１８％葡萄糖的发酵培养基中发酵，转化 品添加剂、水泥增塑剂、洗涤剂和照片显影剂的重要成 率可达９０％。但是，还存在着以下几个问题：（１）发酵 分，在各领域有着广泛的用途。其中， ２ＤＫＧＡ在工业 生产中经常出现噬菌体污染的现象；（２）高浓度葡萄糖 方面最主要的用途是合成食品工业中的食品添加剂Ｄ 对菌体生长产生抑制；（３）发酵液中与２ＤＫＧＡ相似 ［１２］ 异抗坏血酸钠（ＥＮ）及Ｄ异抗坏血酸（ＥＡ） ，广泛用 的组分较多，较难分离；（４）２酮基Ｄ葡萄糖酸的产率 ［３８］ 于食品保鲜、防腐剂和抗氧化剂等 。２０１０年全球的 相对较低，发酵生产过程能耗高。 ［１３］ 　　本研究采用Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒｓｕｂｏｘｙｄａｎｓ，其生长快，耐 ＥＮ及ＥＡ的产量达６万吨左右 ，作为ＥＮ及 ＥＡ的 前体，２酮基Ｄ葡萄糖酸的生产研究具有良好的应用 高渗，耐酸性强，没有噬菌体侵染危害，由葡萄糖产生 前景。 高纯度葡萄糖酸的转化率高、产酸率接近黑曲霉，这些 　　生产２酮基Ｄ葡萄糖酸的方法主要有三种：酶法，