生物素-亲和素反应的放大技术.pptxVIP

生物素-亲合素放大技术第一节 生物素的理化性质与标记一、活化生物素二、活化生物素标记蛋白质第二节 亲合素、链霉亲合素的理化性质与标记　一、理化特性　二、亲合素（或链酶亲合素）的标记第三节 生物素-亲合素系统的特点一、灵敏度　二、特异性三、稳定性　四、适用性五、其他第四节 生物素-亲合素系统的应用一、生物素-亲合素系统基本类型及原理二、生物素-亲合素系统在酶免疫测定中的应用三、生物素-亲合素系统在荧光免疫技术中的应用四、生物素-亲合素系统在放射免疫测定中的应用五、生物素-亲合素系统在分子生物学中的应用思考题小结BABABABC生物素（biotin）、亲和素（avidin）是一对具有高度亲和力的物质，结合迅速、专一、稳定并具有多级放大效应。第一节 生物素理化性质与标记I环为咪唑酮环，可与亲合 素结合Ⅱ环为噻吩环，C2上戊酸侧链的未端羧基是结合生物大分子的唯一结构 生物素（维生素H）动、植物组织中广泛 分布,卵黄和肝含量高分子量小，244.31 DI 咪唑酮环 羧基:可用于活化为其他衍生物Ⅱ噻吩环 一、活化生物素 生物素侧链的末端羧基经化学修饰后制成带各种活性基团的衍生物－活化生物素(生物素化衍生物)为何要活化？活化生物素标记蛋白质氨基的活化生物素 活化生物素易与抗原、抗体、酶及核酸分子中相应基团偶联形成生物素化标记物 标记蛋白质醛基的活化生物素 标记蛋白质巯基的活化生物素 标记核酸的活化生物素 活化生物素标记蛋白质氨基的活化生物素生物素羟基琥珀酰亚胺酯(BNHS)碳二亚胺生物素N-羟基丁二酰胺BNHS分子可与蛋白质 赖氨酸（碱性AA）的氨基形成肽键 BNHS适用标记抗体和 中性或偏碱性的蛋白质生物素分子量小，当与抗体或酶形成生物素标记结合物后，由于大分子蛋白的空间位阻效应，可对生物素与亲和素的结合以及BAS的应用效果造成干扰。如何减小空间位阻？长臂活化生物素（BCNHS）：生物素和N-羟基丁二酰亚胺之间添加了两个6-氨基已糖分子基团，形成连结臂，生物素与大分子基团的距离增加，更易发挥生物素的活性作用。标记蛋白质醛基的活化生物素生物素酰肼(BHZ)：水合肼与生物素的合成物 主要用于标记偏酸性糖蛋白 肼化生物胞素(BCHZ) ：生物素与赖氨酸连接后， 再与无水肼反应而成。 除醛基外， BCHZ还可标记氨基标记蛋白质巯基的活化生物素马来酰亚胺-丙酰-生物胞素（MPB)：能特异地与蛋白质巯基结合的活化生物素 标记核酸的活化生物素光生物素(photobiotin)光敏物质 侧链上连接的芳香基叠氮物基团, 经光照后, 变为芳香基硝基苯，可直接与腺嘌呤氨基结合, 形成B-核酸探针，用于DNA或RNA的标记。 生物素脱氧核苷三磷酸（如Bio-dUTP） 作为TTP的结构类似物，可采用缺口移位法（DNase I和DNA聚合酶I）掺入到双链DNA中。BNHS和BHZ 可直接标记核酸，但对碱基配对有影响。目前常用光生物素和生物素化dUTP作为标记核酸的活化生物素。二、活化生物素标记蛋白质特性：活化生物素通过侧链与蛋白分子连接；一个蛋白分子可被多个生物素标记－多价性（是BAS多级放大作用的物质基础）；BNHS多标记抗体和中性或偏碱性的蛋白质, BHZ则多标记微酸性抗原；抗原、抗体标记后活性不变；可对标记材料（如酶）标记：碱性磷酸酶标记后，活性降低；注意事项：选择活化生物素：依抗原或抗体分子所带可标记基团 的种类（氨基、醛基或巯基）以及分子的酸碱性；控制生物素：蛋白质比例 生物素：IgG 用量比(mg/mg)宜为2:1, IgG应用浓度 0.5~5μg/ml; 生物素1~3个/Ag，3~5个/Ab；使用交联臂减少空间阻力第二节 亲合素、链霉亲合素的理化性质与标记　亲合素(avidin, AV) 和链霉亲合素(streptavidin, SA)是生物素的天然特异性结合物。而且，二者均为大分子蛋白，因此几乎所有用于标记的物质均可以同亲合素（AV）或链酶亲合素（SA）结合。 一、理 化 特 性结构 四亚基糖蛋白 四肽链蛋白 无糖基PI 10.5 6结合位 色氨酸 色氨酸生物素 4 4Ka 1015 1015活性 13～15U 15～18U亲合素（AV）链霉亲合素(SA)SA表面所带正电荷少，且不含糖基，非特异性结合远低于AV，因此目前以SA标记的酶结合物更为常用。二、亲合素/链霉亲合素的标记可标记AV/SA的物质：酶、抗原或抗体、铁蛋白、 胶体金、125I、异硫氰酸荧光素（FITC）等。 HRP-AV(SA)（酶标记蛋白的直接标记法）： 过碘酸钠法、戊二醛法。ABC/SABC