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基于ELISA检测MGMT-DNA交联体的方法建立和评价
叶枫1，程晋，赵远鹏，但国蓉，王宾，赵吉清，邹仲敏*
第三军医大学军事预防医学院毒理学研究所
(1. 293312620@; * 责任作者：zmzou@)
摘 要：
【目的】建立基于ELISA检测O6-烷基转移酶（O6-methylguanine-DNA-methyltransferase,MGMT）-DNA交联物的方法。利用该方法检测氮芥染毒支气管上皮-16HBE细胞3h后MGMT-DNA交联体含量变化。
【材料和方法】支气管上皮细胞-16HBE经10、50、200μM氮芥染毒3h，消化收集染毒细胞。采用一种商品化的DNA提取试剂-DNAiso，利用DNA加合物快速回收法（Rapid approach to DNA adduct recovery，RADAR)进行DNA-蛋白交联物(DNA-protein crosslink，DPC)提取，产物采用8mM NaOH溶解。使用SYBR Green Q-PCR技术，与DNA标准品比较，测定样品中双链DNA（Double strand DNA，dsDNA）的浓度。调整DPC样品DNA含量为2μg后，加入1U 全能核酸酶- HYPERLINK /item.htm?spm=a230r.1.14.3.zFO9Csid=44266166640ns=1abbucket=2 \l detail \t _blank Benzonase，常温反应30min消化基因组DNA，产物与BioLegend公司的Elisa包被液混合，包被酶标板3h，经PBST洗涤3次后进行常规的抗原封闭，高度特异性识别的MGMT一抗孵育，PBST洗涤3次，二抗孵育，PBST洗涤3次后加入TMB液显色15min，加入硫酸终止液后, 在酶标仪上测450 nm波长处的OD值。分别设置纯水样品或不含MGMT抗体的一抗稀释液孵育为阴性对照组，不加氮芥染毒为正常组。Elisa线性范围检测采用200μM氮芥染毒组样品，调整DNA含量为60μg，采用3倍倍比稀释若干组，经Benzonas消化后采用前述Elisa检测方法检测MGMT-DNA交联体。将检测所得OD值与对应各组DNA含量进行标准曲线和相关系数R计算，得出ELISA检测方法的线性范围。
【结果】 阴性对照组加入TMB液后无显色，正常组有显色，50μM及200μM氮芥染毒组显色明显加深，其中50μM氮芥染毒组MGMT-DNA交联体增加略1倍，200μM氮芥染毒组MGMT-DNA交联体增加略3倍。线性范围显示200μM氮芥染毒组样本在80ng至20ug间有良好的线性关系，相关系数R为 0.98。
【结论】成功建立基于ELISA检测MGMT-DNA交联体检测的方法，该方法前期样本处理简便，DPC回收率高，检测灵敏度高，线性范围宽。50、200μM氮芥染毒3h后MGMT-DNA交联体有显著增加，与类似文献报道结果一致。
关键词：Elisa，DNA-protein crosslink，MGMT，DNAiso，Mechlorethamine
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