课件：实验三药物血浆蛋白结合率测定.ppt

实验三 药物血浆蛋白结合率测定 测定方法 平衡透析法 超过滤法 分配平衡法 稳定同位素-GC-MS法 凝胶过滤法 光谱技术 平衡透析法 基本原理 将蛋白置于一个隔室内，用半透膜将此隔室与另一隔室隔开。蛋白等大分子不能通过此半透膜，但系统中游离配基可自由通过。当达到平衡时半透膜两侧自由配基的浓度相等。若系统中自由配基的总量已知，测定不含蛋白隔室中自由配基的浓度，即可推算与蛋白结合的配基量。 重氮化偶合比色测定法 具有游离氨基的磺胺药在酸性介质中重氮化后，可与N-(1萘基）乙二胺产生偶合反应生成紫红色偶氮染料，再与同样处理的磺胺药标准液比较，即可求得磺胺药的含量。 剩余的亚硝酸影响测定，用氨基磺酸胺分解除去 材料与试剂 药物 10%磺胺嘧啶钠注射液 试剂 15%三氯醋酸溶液 0.1%亚硝酸钠溶液 0.5%氨基磺酸胺溶液 0.1%二盐酸N-（1萘基）-乙二胺溶液 磺胺嘧啶钠贮存标准液 磺胺嘧啶钠应用标准液 透析液 （PBS） pH7.4的 0.02M 磷酸盐缓冲液 鸡、兔各三只 管状半透膜 周长5cm，长约12cm 721分光光度计、离心机、天平 注射器、广口瓶、烧杯、三角烧瓶、试管、试管架、漏斗、滤纸、丝线、注射器 设备与器械 试剂的配制 0.02M,?PH7.4磷酸盐缓冲盐液(?PBS) ： 　　贮存液： 　　A液：0.2M?Na2HPO4 Na2HPO4·12H2O?71.64克，加蒸馏水至1000ml； 　　B液：?0.2M?NaH2P4 NaH2P4·2H2O 12克，加蒸馏水至1000ml； 　　应用液：取A液81ml加B液19ml混合，再以生理盐水作10倍稀释即成。 试剂的配制 0.1%二盐酸N-（1萘基）-乙二胺溶液 0.5 g溶于95 %乙醇约400 mL中，再用乙醇稀释至500ml，棕色瓶于冰箱中保存 贮存标准液 取标准品0.125g溶于蒸馏水中，并稀释至1000mL。如不溶于水，可先溶于0.1 mol/L氢氧化钠25mL中，再加4mol/L硫酸175 mL，用蒸馏水稀释至1000mL。 应用标准液 精确吸取贮存标准液3mL，置100 mL容量瓶中，用3%三氯醋酸稀释至刻度。 操作步骤 1. 血浆的制备：兔心脏采血（鸡翼静脉采血），肝素抗凝，以3000rpm离心10min，上清液即为血浆。 2. 将管状半透膜一端折叠，用纱线扎紧，保留结扎线段10cm左右，以调节袋内外液面在同一水平，加血浆样品2.0ml于上述半透膜袋内，并扎紧口袋另一端。注意：袋口不得污染血浆。 3. 将两端扎紧的半透膜置于盛有9.75ml透析液的30ml广口瓶中，用袋两端线段调节袋内外液面 4. 加2.0ml透析液代替血浆于半透膜袋内，作平衡时间对照样品，以确定药物从袋内外自由扩散达到平衡所需时间。 5. 加所试磺胺药溶液0.25ml于各瓶袋外透析液中。注意：容积越小越好，以免影响透析液的组成 6. 置广口瓶于冰箱中，平衡透析时间约需60h左右。 7. 待透析平衡后，吸出袋外透析液少许，加等量磺基水杨酸试剂，检查有无血浆蛋白漏出。如检查为阳性，则该样品作废。 8. 取出半透膜，用滤纸吸干袋外壁透析液，小心解开透析袋，使袋内血浆流入干净试管。 9. 用重氮化-偶合比色法测定袋内外溶液中磺胺药浓度 取袋内外溶液各0.5ml，加水15.5ml；加15%三氯醋酸4ml，混匀，静置2min，过滤 取试管3支，各加入滤液5mL，为测定管 取试管3支，加入空白对照液5mL，为空白管 取试管3支，加入应用标准液5mL，为标准管 在以上各管中各加入0.1%亚硝酸钠溶液0.5mL，混匀，放置3min 各加入0.5%氨基磺酸胺溶液0.5mL，混匀，放 置2min 各加入0.1%二盐酸N-（1萘基）-乙二胺溶液 2.5mL，充分混匀，放置10min 用721分光光度计在550nm波长处比色 以空白管校正光密度到0点，读取标准管和 测定管光密度，计算游离磺胺药物含量 10. 计算血浆蛋白结合率 计算公式 测定管光密度 游离磺胺药含量 （mg%）= 标准管光密度 × 应用标准液浓度×样品稀释倍数 计算公式 fb= ×100% fb：血浆蛋白结合率； Dt：血药总浓度（透析袋内血浆药物浓度）； Df：游离药物浓度（透析