课件：固定化酶与固定化细胞技术.ppt

（1）戊二醛处理菌体细胞：10克菌体（湿重），0.1ml25%戊二醛，混匀。 （2）明胶液配制：1克明胶，加8ml 水溶解。 （3）固定制膜：混合（1）和（2），铺成2-3mm厚的膜，0-5℃凝固1h 。 （4）戊二醛处理：0.25%戊二醛溶液75ml，浸泡24-48h。 （5）成型：机械破碎，成10目大小，蒸馏水洗涤待用。 2、聚丙烯酰胺凝胶包埋法 大肠杆菌和产氨短杆菌已分别用于工业化生产L-天冬氨酸、L-苹果酸。 聚丙烯酰胺凝胶包埋大肠杆菌（L-天冬氨酸酶）： （1）材料准备： 菌悬液：E. coli ATCC II303，1kg菌体（湿重）加2L生理盐水，冷至8℃。 单体溶液：丙烯酰胺750g，N,N’甲叉双丙烯酰胺40g，溶于2.4L水, 冷至8℃。 （2）固定化 ⅰ混合菌悬液与单体悬液,加入催化剂:100ml25%β-二甲基丙腈,500ml1%过硫酸钾。 ⅱ聚合：20-25℃，15-20min（聚合反应约在5min后开始。温度升高，当温度升至30℃时，迅速用冰水冷却）。 ⅲ成型：切成3-4mm颗粒，水洗。 （3）活化细胞 固定化细胞在含有1mM Mg2+的1N反丁烯二酸铵（pH8.5）中，37℃24-48h。（天冬氨酸酶活力可提高9-10倍）。 3、海藻酸盐包埋法 海藻酸为d-甘露糖醛酸和l-古罗糖醛酸通过1,4糖苷键联接而成的聚合物。 （1）海藻酸钠溶液配制：6g溶于96ml水（约6%浓度）。 （2）混合菌体：0.3g湿菌体/ml (30%W/V)。 （3）固化和成型：固化液（含Ca2+、Zn2+、Al3+等多价阳离子溶液，如0.1MCaCl2），将海藻酸钠与菌体的混合液用针形管滴入固化液中。 （4）硬化与洗涤：颗粒放置于0.1M CaCl2浸泡1小时进一步固化。 缺点：在高浓度的电解质（K+、Na+等）中颗粒不稳定。 Ca2+等多价离子会在磷酸缓冲溶液沉淀，导致机械强度降低，和重新溶解。 二、吸附法 细胞表面带有电荷，因此可以通过离子交换或吸附作用结合于载体。该法简便，易于再生，但结合力弱，易脱落。工业应用上较少。 阴离子树脂：固定放线菌（葡萄糖异构酶，生产果糖） DEAE-纤维素：固定巨大芽 孢杆菌（青霉素酰化酶，生产6-APA）。 三、其它 交联法有少量尝试，如含有天冬氨酸酶的大肠杆菌曾用多种双功能试剂交联，发现只有戊二醛交联能获得有活力的制剂，但所得固定化细胞颗粒太细，机械强度差。 共价结合法：少数细菌表面可能存在氨基，如微球菌，可以碳二亚胺脱水与CM-纤维素连接。细胞无生存能力，但仍保留组氨酸氨裂合酶的活性，故引起人们注意，有等进一步的发展。 第三节 固定化酶和细胞的应用 一、在工业方面的应用 1、氨基酸工业 （1）利用固定化酰化酶（细胞）生产L-氨基酸 —DL氨基酸拆分 工业上化学合成氨基酸都是无光学活性的DL型外消旋混合物。须将它进行光学拆分以获得L型氨基酸。 外消旋氨基酸拆分方法:物理、化学和生物学方法，其中以酶法最有效，能够生产纯度较高的L-氨基酸。反应式如下： （2）氨基酸的转化生产 门冬氨酸的生产：利用固定化门冬氨酸酶（细胞，E. coli）生产 HOOCCH=CHCOOH+NH3—→L-门冬氨酸 反丁烯二酸 L-丙氨酸、L-鸟氨酸、L-瓜氨酸的生产：利用固定化门冬氨酸β脱羧酶（细胞，恶臭假单胞菌）生产，其原理是， L-门冬氨酸——→L-丙氨酸+CO2 L-精氨酸——→L-瓜氨酸(冷冻固定化细胞) ——→L-鸟氨酸（不冷冻） （3）固定化细胞直接生产氨基酸 谷氨酸、组氨酸、精氨酸已通过这种方法生产。 2、抗生素工业 （1）从青霉素生产青霉烷酸（6-APA） 青霉素是β-内酰胺类抗生素，都有一个共同母核——6-APA。改变其侧链结构，则可改变其抗菌谱、水溶性、耐酸性、和抗β-内酰胺酶的能力。在发酵法中，对不同的侧链前体进行发酵以生产不同的青霉素进行了广泛的研究，获得近百种，但成功的只有青霉素V，其它则因产率低、产物复杂等原因而无实用价值。 半合成是将6-APA用不同侧链羧酸酰化，进一步合成了许多广谱、耐酸、抗β-内酰胺酶、毒性低、适合不同用途的新抗生素，如氨苄青霉素、对羟苄青霉素、苯甲异恶 唑青霉素、对羟氨苄青霉素……等。 获得半合成起始物6-APA是半合成各种青霉素的关键。发酵法生产6-APA产量低，分离困难。故直接发酵法被排除。50年代酶催化水解青霉素生产6-APA成功。已工业化大规模生产。使用酶法生产6-APA产率很低