课件：冠状病毒实验室检测.ppt

2. London1_novel_CoV_2012_nsp12核苷酸序列与与SARS-CoV-Tor2 株相应区段同源性为73.6% 引物设计与应用 起止位点 引物对 引物序列 (5’-3’) 片段大小 （bp） 备注 7 208 F-1 R-1 TGCTAAGAATAGAGCTCGCACTGTT ACCCATAAGATGCGGATTATCAACA 201 26 134 F-2 R-2 ACTGTTGCAGGCGTGTCCATACTTAGC TAGTACCAATGACGCAAGTCGCTCC 109 49 荧光探针TZ1 CTAATCGCCAGTACCATCAG TaqMan探针 60 荧光探针TZ2 AGCACAATGACTAATCGCCA TaqMan探针 基于上述引物探针，我们已建立常规PCR方法（F-1,R-1；PCR片段201bp)，半套式PCR方法(1stPCR:F-1,R-1; nested PCR: F-1,R-2； PCR片段127bp) 两种荧光定量PCR方法（ F-1,R-2，TZ1；或 F-2,R-2，TZ2) 与其他人冠状病毒无交叉反应；可初步用于新型冠状病毒（2012）的实验室检测。 引物设计与应用2 引物对 引物序列 (5’-3’) 片段大小 （bp） 备注 HKU4-f1 HKU4-r1 GACTAATCGTCAATATCACC ACCCATTAAATGTGGACTC 150 Bat-CoV-HKU4检测 HKU4-f2 ACACCAGAAGAAGAAGAAGAC 135（HKU4-r1 合用） Bat-CoV-HKU4检测 HKU5-f1 HKU5-r1 GACTGTTGCCGCAGAAACGATC ACCCATCAAGTGAGGATTA 185 Bat-CoV-HKU5检测 HKU5-f1 HKU5-r2 GTGAGGATTATCAACATCCTTATAC 170 Bat-CoV-HKU5检测 基于对London-1 Novel Coronavirus 已知序列与Bat-CoV-HKU多株序列比对，我们分别设计了两对针对HKU4和HKU5的引物及其套式引物，可分别用于Bat-CoV-HKU4和HKU5核酸特异性检测。 巢式PCR 普通PCR PCR产物电泳或测序 逆转录，获得cDNA 核酸提取 荧光定量PCR 鼻咽拭子标本 PCR检测 实验方案 核酸(基因)检测 基因扩增(PCR) 靶序列 模板DNA 35个循环 340亿 拷贝 标本中存在病毒核酸，但不一定存在活病毒 可以确定存在感染 PCR产物可以测定核苷酸序列，确定病原需要较好的经验 冠状病毒检测通用引物对: Cor-FW (5-ACWCARHTVAAYYTNAARTAYGC-3) Cor-RV (5-TCRCAYTTDGGRTARTCCCA-3‘) 冠状病毒通用引物RT-PCR扩增产物电泳 One-step RT-PCR assays (OneStep RT-PCR kit; QIAGEN) a 50 μl reaction volume containing 10 μL RNA-extract, 10 μl 5x QIAGEN OneStep RT-PCR Buffer, 2 μl dNTP mix (final concentration of 400 μM of each dNTP), 1.8 μl QIAGEN OneStep RT-PCR Enzyme Mix (a combination of Omniscript and Sensiscript reverse transcriptase and Hot-StarTaq DNA polymerase), 4 μM of each primer, and RNase-free water to 50 μl. The reaction was carried out with an initial reverse transcription step at 50°C for 30 min, followed by PCR activation at 95°C for 15 min, 50 cycles of amplification (30 sec at 94°C; 30 sec at 48°C; 1min at 72°C), and a final extension step at 72°C for 10 min 定量 PCR，TaqMan体系 ABI 公司首先推出(PRISM 7000系列) 。 实时检测: 每个循环都会产生与PCR产物成正比的荧光物质 定量RT- PCR检测 试剂