课件：《种烟草病毒TMV》PPT课件.ppt

五种烟草病毒TMV、CMV、TEV、PVY 及TVBMV 的多重RT-PCR同步检测 植物病理学报 ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA 41( 2): 146-153( 2011) 介绍 烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus；TMV），又译为烟草花叶病毒，是一种RNA病毒，专门感染植物，尤其是烟草及其他茄科植物，能使这些受感染的叶片看来斑驳污损 我国烟草病毒主要有烟草花叶病毒( TMV) 、黄瓜花叶病毒( CMV) 、烟草蚀纹病毒( TEV) 、马铃薯Y 病( PVY) 和烟草脉带花叶病( TVBMV) ，通常发生复合侵染。本研究对我国5 种烟草病毒的外壳蛋白基因部分序列设计引物，建立了能同时检测TMV、CMV、TEV、PVY 和TVBMV 的多重RT-PCR 检测体系。对田间样品检测结果证明，多重RT-PCR 体系能够同时检测5 种病毒，并且灵敏度高 目前检测手段 目前检测烟草病毒的主要方法有电镜法、血清学鉴定以及PCR 技术。其中PCR 技术具有快速、便捷、灵敏度高和特异性强等显著优点。 多重RT-PCR技术：多重PCR 是在同一反应体系中加入两对以上特异性引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR 反应，具有高效性、系统性和经济简便性等特点，现在已应用于基因诊断和病原微生物的检测与鉴别。 检测步骤 1．1 病毒总RNA 的提取 TMV、CMV、TEV、PVY 和TVBMV 核酸均为线状单链正义RNA。植物总RNA 的浓度及纯度是影响RT-PCR 检测的关键因素，其提取方法有十二烷基硫酸钠和硫氰酸胍抽提等，但是这些方法中提取缓冲液的配置操作繁琐，提取过程耗时长，容易造成总RNA 降解。为高效、快速提取植物总RNA，并对植物病毒进行PCR 检测，本研究用Biozol试剂盒提取烟草总RNA，并进行多重RT-PCR同时快速检测TMV、CMV 、TEV、PVY 和TVBMV等5 种主要烟草病毒 检测步骤 1．2引物的设计与筛选 应用Primer Premier 5． 0 引物设计软件分别设计这5 种病毒的特异引物TMV cpF /TMV cpR、CMV cpF /CMV cpR、TEV cpF /TEVcpR、PVY cpF /PVY cpR 和TVBMV cpF /TVBMVcpR。由于多重RT-PCR 要求在同一退火温度下同时扩增多个目的片断，因此对设计的大量引物进行筛选，选择Tm 值较一致的各对引物，以保证在同一退火温度下同时检测到TMV、CMV、TEV、PVY 和TVBMV 这5 种病毒 检测步骤 1.3 单重RT-PCR 用M-MLV 反转录酶反转录合成各病毒cDNA 第一链 25 μL PCR 标准反应体系: 14． 3 μL ddH2O，2． 5 μL 10 × PCR buffer ［750 mmol /L Tris-HCl( pH8． 8) ，200 mmol /L ( NH4 ) 2SO4，0． 1% Tween20］，2 μL 25 mmol /L MgCl2，2 μL dNTP( 各2． 5mmol /L) ，1 μL 上游和下游引物混合物( 各10μmol /L) ，0． 2 μL Taq DNA 聚合酶( 5 U /μL) 和2 μL cDNA 模板。PCR 反应循环参数: 94℃预变性3 min; 94℃变性30 s，48℃退火30 s，72℃延伸1 min，循环30 次; 72℃延伸10 min。取5 μL PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳分析比较 单重RT-PCR电泳检测结果 以TMV、CMV、TEV、PVY 和TVBMV 5 种病 毒的反转录产物作为PCR 反应的模板，经PCR 扩 增分别得到大小为237、273、347、456 和547 bp 的5 条特异性条带 检测步骤 1.4 多重RT-PCR 多重RT-PCR 反应体系: 取TMV、CMV、TEV、PVY 和TVBMV 5 种病毒的混合病株提取总RNA，反转录合成cDNA，将RT 产物随机混合作为多重RT-PCR 反应的模板，将各病毒特异性引物同时加入一个反应管进行PCR 反应。 退火温度分别选择42℃、45℃、48℃、51℃、54℃和57℃; 延伸时间分别为40、50、60、70、80 和90 s; 循环次数选择20、25、30、35、40 和45 个循环进行多重RT-PCR体系优化 优化后的5 对引物比例为TMV ∶ CMV∶ TEV ∶ PVY: TVBMV = 1.4 ∶ 1 ∶ 1 ∶ 1 ∶1.5，5 种模板的比例为TMV ∶ CMV ∶ TEV ∶PVY∶ TVBMV = 1． 4∶ 1∶ 1∶ 1∶ 1． 6。。结果 显示，退火温度在48℃和51℃所获得的目的条带