DNA AN 琼脂糖凝胶电泳.ppt

核酸的提取及琼脂糖凝胶电泳 目录  核酸的理化性质 理化性质 DNA化学性质稳定，物理上易碎，粘度大 RNA化学性质比DNA活泼，易受RNA酶的污染 溶解性 均溶于水 不溶于一般有机溶剂,在70%乙醇中形成沉淀 核酸分离、纯化原则 1、保持核酸分子一级结构的完整性 温度不要太高 控制pH值范围(pH值5-9) 保持一定离子强度 减少物理因素对核酸的机械剪切力 核酸分离、纯化原则 核酸酶能消化核酸链中的磷酸二酯键，破坏核酸一级结构。 所用器械和一些试剂需高温灭菌 提取缓冲液中需加核酸酶抑制剂 DNA酶抑制剂 金属离子螯合剂： DNA酶需要金属二价离子Mg2+、Ca2+的激活，常用EDTA(乙二胺四乙酸)离子螯合剂，可抑制DNA酶活性。 阴离于型表面活性剂 SDS除对核酸酶有抑制作用外，还能使蛋白质变性，并与变性蛋白结合成带负电荷的复合物，该复合物有核酸酶抑制剂作用。 RNA酶（RNAase)抑制剂 DEPC(二乙基焦碳酸盐) 粘性液体，很强的核酸酶抑制剂。与蛋白质中His 结 合使蛋白变性。 使用注意： 1.DEPC也能破坏单链核酸中大部分腺嘌呤环。 2.容易降解，保存在4 ℃或液氮中； 3.剧毒。 1：手指头 2：枪头 3：水/缓冲液 4：实验台面 5：内源 Rnase 6：RNA 样品 7：质粒抽提 8：RNA 保存 9：阳离子 (Ca, Mg) 10：后续实验所用的酶 材料准备 细胞裂解 裂解液 经典的裂解液几乎都含有去污剂和盐，可以抑制样品中的核酸酶 核酸分离、纯化 蛋白质的去除： 酚/氯仿抽提 使用变性剂变性（SDS、异硫氰酸胍等） 高盐洗涤 核酸-蛋白质加入NaCl后，破坏静电吸力，使氢键破坏，核蛋白解聚； 蛋白酶处理 核酸分离、纯化 多糖的去除： 高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体积的5M NaCl，高盐可溶解多糖。 用多糖水解酶将多糖降解。 在提取缓冲液中加一定量的氯苯，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖 。 核酸沉淀、溶解 有机沉淀剂 核酸的保存 (1) 对DNA ① DNA样品溶于pH8.0的TE，4 ℃或-20 ℃保存； ② 长期保存样品中可加入1滴氯仿。 (2) 对RNA ① RNA样品溶于0.3 mol/L NaAc (pH5.2)或双蒸灭菌水中，-70 ℃保存; ② 长期保存可以沉淀形式贮于乙醇中; DNA提取的常用方法 基因组DNA－SDS法 　吸附材料结合法： 目前有不少商业化的核酸抽提试剂盒可供选用，具体操作步骤参考各种产品说明书。 为了检测提取核酸的浓度和内参，需要继续做琼脂糖凝胶电泳实验 电泳常见问题分析 实验原理 （1）DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。分子质量越小跑得越快，紧密构型快于松散型开环分子或线性分子，从而可以分离大小不同的DNA或RNA分子。 （2）琼脂糖是一种线性多糖聚合物，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。 琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶缓冲液 （1）制备凝胶和胶板： 100ml(1×TBE)+1g琼脂糖（ 三角瓶 ）， 煮胶，溶解，冷却至60℃(不烫手)，加EB替代物，倒板(4-6mm)，室温下充分凝固，竖直拔下梳子 。 （2 ）加样： 5μl质粒DNA+1μl loading buffer ，混匀 5μlPCR产物+1μl loading buffer，混匀 （3 ）电泳：电压80-120V，注意电极 方向 15min （4 ）观察：紫外透射分析仪下观察。 DNA降解：避免核酸酶污染。 电泳缓冲液陈旧：电泳缓冲液多次用后，离子强度降低，pH值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果。建议经常更换电泳缓冲液。 DNA变性：电泳前勿加热，可以在电泳仪上面放冰袋，避免温度高变性 条带浅，Marker弥散了---那要么就是胶的问题，要不就是buffer的问题。化胶的时候一定要化匀，buffer尽量用新鲜的实验室跑一般都是12