广东省寨卡病毒实验室检测机构工作指引.docVIP

广东省寨卡病毒病实验室检测机构工作指引 （2016年第一版） 为及时检测和确认寨卡热病例，规范实验室检测程序，提高检测质量，特制定本指引。 检测对象 包括疑似病例,临床诊断病例及相关人员，埃及伊蚊和白纹伊蚊成蚊。 二、标本采集、保存和运输 （一）标本采集。 唾液标本：急性期病例用干燥的无菌的标本采集管采集唾液3-5ml。唾液按1.5ml每管分装，分装成3管。 血液标本：急性期病例用分离胶无菌真空促凝管或干燥管采集5mL以上静脉血，采集后用封口膜封闭管口，标记清楚后放入自封袋或50mL离心管内，并在自封袋或离心管外表面再清楚标记，4℃保存，填写标本采集登记表。采集的血液标本离心后用2ml螺旋管按500μl一管，分装成3管。确诊病例应采集恢复期血标本。 尿液标本：用小便采集器或干燥采样管采集5-10ml的尿液。尿液按每管2ml分装，直至全部分装完成。 结膜拭子：用干棉签采集结膜拭子和泪液，采集的拭子放入含有2mL病毒培养液的采样管中保存，震荡后分装成3管。 精液等其它标本：必要时男性病例可采集精液2-3ml。有神经系统症状时可采集脑脊液2ml.精液平均分装成3管。 所有标本采集后做好标记，并填写标本采集登记表（附表1）。 （二）采集时间。 一般发病后1周内，可在患者唾液和血液标本中检测到病毒核酸和抗原，其中2-5天检测阳性率高，唾液与血液相比具有更高的阳性检出率；发病后15天（最长可达20天）内病人尿中病毒核酸仍可检测出；发病28天内病人精液中可检测出病毒核酸。最早可从发病后3天的患者血清中检出特异性IgM抗体，IgM抗体可维持数月。发病后2-3周可检出IgG抗体，康复者IgG抗体可维持数年。 （三）标本保存、运送。 未分离血清的全血标本应放4℃保存，并尽快送到实验室分离血清和检测；血清、唾液、尿液和精液等其它标本长期保存应置于-70℃或以下冰箱保存， 1周内保存可置-20℃冰箱。标本运输应按照相关生物安全规定，低温冷藏运输，避免反复冻融（附件1）。 所有疑似或确诊寨卡病例相关感染性标本的运输应按照《病原微生物实验室生物安全管理条例》和《人间传染的病原微生物名录》等相关规定，采取B类包装，符合UN3373要求。运输时要填写标本说明两份，写明标本的详细情况、运送者及接收者地址，将标本说明密封在塑料袋里，用胶布分别粘在外层包装的里面和外面并留档以便追踪，方便实验室操作人员查对标本数量。样本运输之前，应按相关生物安全规定和样本接收单位生物安全管理部门联系，办理相关手续，运送日期确定后立即将运送的时间和运输方式通知接收单位。 寨卡病毒核酸阳性标本，应根据《病原微生物实验室生物安全管理条例》等相关生物安全规定保存，实行安全管理。寨卡病毒核酸阴性血标本，应在排除寨卡病毒感染后，转入其他血清库保存或销毁。所有感染性血清销毁时，可用高压灭活。所有销毁样本均应在相应数据库清单内标明，并记录销毁的时间和操作人，阴性样本销毁记录应保存1年以上，阳性样本的销毁记录应保存5年以上。 （四）送检流程。 三、检测内容 寨卡病毒核酸检测、寨卡病毒培养、寨卡病毒抗原和抗体检测。 四、实验室检测方法 （一）病原学检测。 1．核酸检测：是目前早期诊断、早期发现寨卡病例的主要检测方法。为提高检测的敏感性和特异性，用实时荧光定量RT-PCR 方法针对寨卡病毒的特定基因进行检测，在病例筛查时，检测阳性即可判为寨卡病毒阳性。传统RT-PCR因易出现污染，较少使用，但可以获得病毒基因序列。 2. 病毒分离培养：寨卡病毒可用C6/36,Vero等细胞分离，但分离率较低；乳鼠颅内接种成功率高。 3. 病毒抗原检测：用酶联免疫法检测寨卡病毒抗原，病毒抗原检测阳性可有助于确诊。 （二）血清学检测。 1. 血清特异性IgM抗体：采用捕获法ELISA方法检测。IgM抗体易于其它黄病毒发生交叉反应，阳性结果应排除其它黄病毒感染后方可确诊。 2.血清特异性IgG抗体：目前采用间接法ELISA检测IgG抗体。单份血清寨卡病毒IgG抗体阳性提示存在曾感染寨卡病毒的可能，双份血清寨卡病毒IgG抗体阳转或恢复期滴度较急性期4倍或者以上增高者，在排除既往或现在感染其它黄病毒情况下可确诊。 （三）结果的报告、复核和反馈。 各地级以上市疾控中心作为寨卡病毒检测单位，所有寨卡病毒阳性标本和30%的阴性血清标本送省疾病预防控制中心病原微生物检验所进行复核检测。实验室阳性检测结果应及时反馈标本送检单位，并尽快上报上级主管部门（附表2）。 五、生物安全 寨卡病毒在我国现归属三类病原体，采集样本时和实验室检测时采用二级生物安全个人防护，其它要求按照《病原微生物实验室生物安全管理条例》等相关规定要求，做好生物安全工作。 附表：1. 寨卡病毒病相关样品送检表 2. 寨卡病毒病实验室检测结果一览表 附表1 寨卡病