从土壤中快速提取纯化DNA方法的建立-河北师范大学学报.PDFVIP

第 32 卷/ 第 1 期/ 河北师范大学学报/ 自然科学版/ Vol . 32 No . 1 2008 年 1 月 J OURNAL OF HEBEI NORMAL UNIVERSITY/ Natural Science Edition/ J an . 2008 从土壤中快速提取纯化 DNA 方法的建立 1 1 1 1 2 1 栗若兰 , 　郑智慧 , 　张 　华 , 　路新华 , 　赵宝华 , 　贺建功 ( 1. 华北制药集团新药研究开发有限责任公司 微生物药物国家研究工程中心 ,河北 石家庄 　0500 15 ; 2 . 河北师范大学 生命科学学院 ,河北 石家庄 　0500 16) 摘 要 : 比较了从土壤中提取及纯化 DNA 的不同方法 ,确立了 TEN S乙酸铵提取方法和 PV PP 柱层析的纯化 方法. 结果显示 : TEN S乙酸铵提取方法对不同土壤均有较好的提取效果 ,DNA 片段长度在 23 . 1 kb 以上 ,且无明 显降解 ;PV PP 柱层析的纯化方法比胶回收纯化方法的DNA 回收效率高 、质量好 ,可用于 PCR 扩增. 关键词 :土壤微生物 ; DNA 提取 ; DNA 纯化 ; PCR 中图分类号 :Q 939 . 96 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 (2008) 0 1009803 在传统微生物学中 ,研究利用微生物首先要进行分离培养. 由于土壤微生物生态系统极为复杂及培养条 件的限制 , 目前可在实验室培养的微生物还不到自然界中微生物总数的 1 % ,还有相当多的菌种因无法人工 培养而未被人类所认识[ 1 ] . 随着分子生物学的发展和研究手段的更新 ,人们现在已经有可能绕过微生物菌 种分离培养这一步骤 ,直接在基因水平上研究和开发未培养微生物资源[2 ] . 在基因水平上研究土壤微生物的技术关键之一是获得高浓度 、大片段 、多样性程度高 、具有代表性并且 可进行分子操作的土壤微生物混合基因组 DNA . 由于土壤成分复杂 、不同土壤样品之间差异较大 ,微生物仅 为其中极小的一部分[3 ] ,并且微生物细胞通常紧密吸附于土壤颗粒表面 , 因此 ,从土壤样品中高效地获得 DNA 具有相当难度. 另外 , 由于土壤中通常含有较多的可与 DNA 共同提取出来的物质 ,如腐殖酸 、重金属离 子等 ,这些物质会影响对 DNA 进行分子操作[3 ,4 ] ,使纯化 DNA 较为困难. 因此 ,建立土壤 DNA 的提取纯化 方法对于在分子水平上研究土壤微生物具有重要意义[5 ] . 目前从土壤中提取 DNA 的方法可分为直接法和间接法 2 类. 直接法采用原位裂解土壤微生物的方法 , 回收后做 DNA 纯化 ; 间接法采用差速离心回收菌体 ,裂解菌体回收 DNA 并纯化. 直接法裂解微生物细胞包 括以下几种方式 :加热 、表面活性剂 、酶解 、酚 、硫氰酸胍 、ED TA 、反复冻融 、超声处理 、微波加热 、玻璃珠破碎 等[6 ] . 其中一些方法虽然能够得到较好的提取效果 ,但步骤繁琐 ,且需要专用仪器. 本文中 ,笔者比较和改进 了从土壤中提取及纯化 DNA 的几种方法 ,建立了一套高效 、快速 、简便的方法 ,对土壤微生物代谢产物的基 因筛选研究提供基础. 1 　材料与方法 1. 1 　材 　料 土样采 自全国各地不同生境的土壤样品 ,保藏于 4 ℃,取样时随机抽取. 1. 2 　方 　法 1. 2 . 1 　从土壤提取 DNA 方法比较 ( ) [7 ] ( 方法 1 TEN S PV P 法 :0 . 5 g 土样中加入 2 mL 清洗液 50 mmol/ L Tris ,p H 8 . 0 ;200 mmol/ L N aCl ; 5 m