基于toxR基因病原哈氏弧菌PCR检测方法的建立-水产科学.PDFVIP

第30卷第9期 水产 科 学 V01．30No．9 2011年9月 FISHERIESSCIENCE sep．201l 姚东瑞，朱 明，陈 丽，毕可然，史爱琴，张晓君 (淮海工学院海洋学院，江苏省海洋资源开发研究院，江苏连云港222005) 摘要：基于toxR基因序列设计检测哈氏弧菌的1对特异性引物，通过PCR反应条件优化、PCR反 应特异性及敏感性检测，建立一种哈氏弧菌的特异性分子检测方法。试验结果表明．该引物可使哈氏 弧菌扩增出大小为390 bp的toxR基因片段，3种水产动物病原弧菌未扩增出任何条带，敏感性检测结 果为该PCR反应最低能检测出o．375 ng／弘l的哈氏弧菌基因组DNA．该试验建立的基于toxR基因 的哈氏弧菌的PCR检测方法可用于哈氏弧菌引起的水产动物疾病的快速诊断及海产品安全检测． 关键词：to】汛基因；哈氏弧菌；PCR检测 中图分类号：S917．1 文献标识码：A 文章编号：1003—11ll(2011)09一0559一04 病原细菌的传统检验方法已远远不能满足水 “m 产养殖生产上对各种病原细菌的诊断要求。为了 有效地预防和控制细菌性病原对水产养殖业的危 Zis口e)、最小弧菌(阢优im站“s)及河流弧菌(矿 害，选择合适的分子靶标，研究开发灵敏度高、特异 ∥“口勉Z括)[133等，同时异种之间的toxR基因核苷酸 性强的病原菌快速检测方法，以确定养殖水体或养 序列相似性较低，是弧菌科种间鉴定的良好分子靶 殖动物体内是否存在对水产养殖动物可能造成危 标。笔者以编码toxR基因为靶基因建立了快速检 害的病原。已成为目前水产动物养殖生产的健康和 测病原哈氏弧菌的PCR方法，通过特异性试验、敏 可持续发展的重要保障。哈氏弧菌(Ⅵ6riD，l口r一感度试验、应用性试验证实该方法特异性好、灵敏 移Pyf)分布极为广泛，是海水中一种常见的致病菌， 度高、稳定性好、检测耗时短，是快速检测哈氏弧菌 对海水鱼、虾及贝类等海水养殖动物均具有致病 的有效方法，以期为由哈氏弧菌引起的疾病的诊断 性[1{]，因此哈氏弧菌快速分子检测方法的研究，以 及流行病学研究奠定基础。 确定发病动物体或养殖水体是否存在该病原，并有 1材料与方法 效地预防和控制其对水产养殖业的危害，具有重要 的实践意义。 1．1供试菌株来源 toxR基因广泛分布于弧菌科细菌，该基因首 供试哈氏弧菌分离自江苏连云港赣榆县发病 先是在霍乱弧菌中发现[6]，由它编码的跨膜转录调 控蛋白toxR参与调控霍乱弧菌的一些主要毒力基弧菌、副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌(原美人鱼弧菌 因和外膜蛋白的表达[7]。目前toxR基因已在多种 表型及分子鉴定n¨引，本实验室保存供用，菌株编 弧菌中发现，如副溶血弧菌(V．加r口^口emoz∥fc一 号及在GenBank登录号见表1。 “s)[81、创伤弧菌(V．t，“Z竹i∥f“s)[91、哈氏弧菌、费氏 0。、发光杆菌(P^D￡06口以P，-} 弧菌(V．^sfJIlP一)n 裹1供试菌株及萁来豫 收稿日期l2010—11一09I修回日期：2010一12—27． 项目(BK2009163)． 作者简介t姚东瑞(1967一)，男．教授，博士．研究方向t现代渔业技术‘E·mail，yaodr@hhit．edu．cn． 万方数据