制作单色双重染色的透明骨骼标本.DOC

PAGE 1 製作（單色、雙重）染色的透明骨骼標本 中興大學生命科學系吳聲海 材料 燈箱 染色盒 福馬林 磷酸氫鈉（Na2HPO4） 磷酸二氫鈉（NaH2PO4） 絕對酒精 冰醋酸 Alcian Blue 8GX或8GN粉末 氫氧化鉀 過氧化氫（3%） 硼沙（Na2B4O7?10H2O） 胰蛋白脢（trypsin） Alizarin Red S粉末 甘油 麋香草酚結晶（thymol, C10H14O） 水合氯醛（chloral hydrate, C2H3Cl3O2） 二甲苯（xylene） 溶液備製 1、 Alcian Blue染劑 溶劑：40份冰醋酸及60份絕對酒精（或20份冰醋酸及80份的95%酒精） 每100ml溶劑中溶入0.01g-0.03g Alcian Blue粉末 註1：若ph值低於1或高於3、或溶液產生強烈的酯味時，即不可再用。 註2：此溶液可重複使用，需放入冰箱冷藏。 2、2% KOH 3、飽和硼砂溶液 將過量的硼砂加入一公升或更多的蒸餾水中，攪拌均勻，讓過多的粉末沉澱後，使用上清液。 4、Alizarin Red S 溶液 a. 將過量的Alizarin Red S粉末溶於15ml的50%冰醋酸中（使飽合） b. 30ml甘油 c. 180ml的1% chloral hydrate （1.8g chloral hydrate溶於180ml蒸餾水） 將a、b、c三者混合均勻，以褐色瓶保存。 5、Trypsin溶劑 30份飽合硼砂溶液加70份蒸餾水 方法 以下所列步驟適用於對生物標本之透明化和雙重染色，要注意二件事： (1) 使用較小生物體以便獲得均勻染色。 (2) 染色不宜過濃，以免妨礙觀察。 1、固定 可用中性福馬林或95%酒精，固定一週以上時間，每兩天換一次酒精（或先以福馬林固定30~60分，再以95%酒精固定一週）。 2、清洗 (1) 福馬林固定標本以水清洗1~2天，酒精固定標本可以不必清洗。 (2) 記錄標本的： a、性別；b、標準長或其他型質；c、發育階段（幼體或成體或亞成體） (3) 將標本剝去表皮或去鱗（魚類），摘除內臟，將表皮及內臟編號另以容器保存。大塊的肌肉必須拿掉。輕輕割開薄層肌肉，避免傷及軟骨和其他骨骼，以便於染劑與其他溶液滲入。此外，含多量色素的區域，如眼球等也應該拿掉。 3、 脫水（染色準備） 將標本依70%酒精95%酒精絕對酒精I絕對酒精Ⅱ之順序脫水，每一步驟至少24hr。 4、去脂（非必要步驟） 將標本以二甲苯除去脂肪，時間和換藥次數視標本大小而定。 5、Alcian blue染色 標本由絕對酒精或二甲苯（如果有進行去脂步驟 ）移入Alician blue溶液中，3~5cm大小的標本染色時間在3~5hr。標本須完全浸入染劑中，判定染色程度可將標本由染劑中取出，置於解剖顯微鏡下觀察，最外層軟骨（如指骨或趾骨尖端、胸骨、肋骨末稍）若呈藍色表示已染上顏色。由於後續步驟會造成些許褪色，因此染深一點可能會有較好的效果。儘可能採高濃度，短時間的染色方式. 6、中和（neutralization） 將染好的標本置入飽和硼砂溶液中，溶液體積約為標本大小的50倍。浸入硼砂中24小時後，換新鮮硼砂溶液，再經24hr，即可進行下一步驟。 注意：如果染色過程須要中斷，可在此步驟完成後，以70%酒精保存標本。一旦開始進行下一步驟，就必須作完全流程。中斷後再進行時，需由步驟2開始。 7、透明化（clearing） 將標本置於酵素溶劑中，其體積為標本大小的10~20倍。隨後加入約0.45g（1/4茶匙）的trypsin，混合均勻。但勿攪拌。將標本置於溫暖處，最好是光源附近。每2~4天溶液變黃及混濁，是正常的狀況。大約一週更換一次酵素溶劑及trypsin，直到標本的骨骼在關節處，開始呈現鬆弛的程度，可移至下一步。（可將標本及溶液在夜間放入冷藏庫，以減緩作用時間） 8、漱洗（rinsing） 將標本移入0.5%KOH溶液中漱洗，去除殘餘酵素。 9、Alizarin Red S 染色 先將5ml Alizarin Red溶液液與2%KOH溶液混和，再將標本浸入此一混合染劑中至骨骼呈色。如有需要，也可使用較多量的Alizarin Red，但可能造成染色過度。 注意：若標本很小或已開始分離，最好是降低KOH濃度到1%或0.5%。 10、 甘油保存 標本經雙重染色，先用0.5%KOH漱洗，再置入一序列的甘油--2%KOH混合液或甘油--65%酒精混合液中。若標本較大或有未透明的肌肉組織，最好以甘油--KOH混合液處理；若標本太小或有解體可能，則以甘油--65%酒精混合液處理為佳。 混合液序列： (1)甘油：KOH（or酒精） = 3：7（體積比） (2)甘油：KOH（or酒精） = 7：3（體積比） (3)100%