赣南医学院生物化学与分子生物学教研室.PDF

Gannan Medical University 赣南医学院 生物化学与分子生物学教研室 Gannan Medical University 目的 1. 熟悉琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒DNA 的 实验原理。 2. 掌握琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒DNA 的 实验操作。 Gannan Medical University 原理 Ø 电泳：带电质点在电场中沿着电性相反移动的现象。 ØDNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下 向正极泳动。 Ø不同的DNA ，分子量大小及构型不同，电泳时的泳动 率就不同，从而分出不同的区带 （迁移速度与分子量 的对数值成反比关系）。 ØDNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子 筛效应。 Gannan Medical University 原理 Ø DNA分子大小迁移速率U与 1、 DNA的分子大小 logN成反比 （N为碱基对数 目）。分子越大，摩擦阻力越 2 、 琼脂糖浓度 大，同时大分子通过凝胶孔径 3 、 DNA分子的构象 的效率也低于较小的分子，所 以分子大的迁移慢。 4 、 电源电压 Ø 等量的空间结构，紧密的电泳 快 （超螺旋线性DNA ）。 5 、 嵌入染料的存在 Ø 一般来说，分子带的电荷量越 大、直径越小、形状越接近球 6 、 离子强度影响 形，则其电泳迁移速率越快。 Gannan Medical University 原理 1、 DNA的分子大小 2 、 琼脂糖浓度 3 、 DNA分子的构象 4 、 电源电压 5 、 嵌入染料的存在 6 、 离子强度影响 Gannan Medical University 原理 抽提中各种因素的影响，质粒DNA可能以三种形式存在： 1. 共价闭环DNA （covalently closed circular DNA ， cccDNA ），常以超螺旋形式存在； 2. 开环DNA （open circular DNA ，ocDNA ），此种质 粒DNA 的两条链中有一条链发生一处或多处断裂，可 以自由旋转从而消除了张力，形成松弛的环状分子； 3. 线状DNA （linear DNA ，lDNA ），质粒DNA 的两条 链在同一处断裂所形成。 在电泳时，同一质粒DNA 的泳动速度根据迁移率： 超螺旋DNA线状DNA 开环DNA cccDNA含量越高，表明制备的质粒DNA质量越好。 Gannan Medical University 原理 1、 DNA的分子大小 2 、 琼脂糖浓度 3 、 DNA分子的构象 Ø 低电压时，线状DNA 的迁移 率与所加电压成正比。为了 4 、 电源电压 使分辨效果好，凝胶上所加 5 、 嵌入染料的存在 电压不应超过5-8V/cm 。