基因工程原理及技术_1_2.pptVIP

用途：①给载体和外源DNA (如cDNA或随机切割DNA)接上同聚物尾，以便连接； ②末端标记 二、核酸酶 核糖核酸酶(RNase)：水解RNA 脱氧核糖核酸酶(DNase)：水解DNA 核酸酶(nuclease)：水解RNA和DNA (一) 核糖核酸酶 1、核糖核酸酶A (RNase A) RNase A是一种内切核糖核酸酶，可特异攻击RNA上嘧啶残基的3’端磷酸酯键。其反应条件极宽，且极难失活。在低盐浓度(0~100mmol/L NaCl)下，RNase A切割单链和双链RNA、DNA/RNA中的RNA；当NaCl浓度为300 mmol/L或更高时，RNase A就特异性切割单链RNA。 RNase A的用途: ①确定RNA或DNA中的单碱基突变的位置； ②通过RNA杂交技术检测特定RNA(特异降解单链RNA，对杂交双链RNA不起作用)，较northern 杂交灵敏； ③转录起始点及内含子剪接位点的分析，其灵敏度比S1核酸酶分析法高数倍； ④降解DNA样品中的RNA分子。 2、核糖核酸酶T1 RNase T1 也是一种内切核糖核酸酶，可特异攻击RNA上鸟嘌呤残基的3’端磷酸酯键。其催化活性与用途类似于RNase A。 3、核糖核酸酶H RNase H特异地降解DNA/RNA杂交双链中的RNA链，产生具有3’-OH和5’-磷酸末端的寡核苷酸和单核苷酸，不能降解单链或双链的DNA或RNA。 其用途是产生cDNA第二链合成的引物。 RNase H Pol I dNTP Pol I dNTP DNA连接酶 (二) 脱氧核糖核酸酶 I DNase I是一种内切脱氧核糖核酸酶，可从嘧啶核苷酸5’-端磷酸随机降解单链或双链DNA，生成具有5’-磷酸末端的寡核苷酸。 Mg2+ Mn2+ 用途：①产生大肠杆菌DNA聚合酶I切口平移的切口； ②在 Mn2+存在下，产生构建 基因组文库的大片段DNA； ③DNasel足迹法测定DNA结合蛋白在DNA上的精确结合位点； ④ 除去RNA样品中的DNA。 (三) S1核酸酶 作用特点： ①需要Zn2+和酸性条件(pH4.0~4.5)； ②降解单链DNA或RNA，但降解DNA的速度大于降解RNA的速度(7倍)； ③降解方式为内切和外切，内切为主； ④酶量过大时也可降解双链核酸，为单链的 1/75 000。 用途： ①切掉DNA片段的单链突出末端产生平头末端； ②在双链cDNA合成时切除发夹环结构； ③S1核酸酶作图分析。 如内含子的数目、大小、位置分析及转录起始位点与终止位点分析等。 内含子数量及大小的分析 DNA mRNA 分子杂交 RE RE S1核酸酶 变性凝胶电泳 M A B M：分子量Marker A：未经S1酶处理 B：经S1酶处理 但不能定位内含子 转录起始点的定位分析 RE RE RE酶切 碱性磷酸酯酶 多核苷酸激酶 * * 变性后与mRNA杂交 * S1核酸酶 * 变性凝胶电泳 M A B 三、核酸外切酶 核酸外切酶(exonuclease)是一类从多核苷酸链的末端开始逐个降解核苷酸的酶。 单链核酸外切酶：E.coli exo Ⅰ、exoⅦ 双链核酸外切酶：exoⅢ 单双链核酸外切酶：Bal 31核酸酶 1、大肠杆菌核酸外切酶VII 3’→5’外切酶活性 5’→3’外切酶活性 用途:①抹平DNA末端；②回收dA/dT接尾克隆的cDNA。 2、大肠杆菌核酸外切酶III 3’→5’外切酶活性 Exo III Mg2+ 核酸外切酶活性 P P Exo III Mg2+ 3’磷酸酶活性 Exo III Mg2+ ssDNA 无反应 无嘌呤或无嘧啶位点 Exo III Mg2+ 核酸内切酶活性 RNA/DNA 构建单向缺失突变体库 3’突出黏性末端 5’突出黏性末端 Exo III S1 核酸酶 克隆 单向缺失突变体克隆 3、Bal 31 核酸酶 Bal 31 核酸酶主要为3’外切酶活性，同时伴有5’外切及较弱的内切活性，需要Mg2+和 Ca2+。 ①对于单链DNA，具有特异的内切酶活性，可从3’-OH末端迅速降解DNA，而5’端切割速率较慢； ②对于双链DNA，具有3’→5’外切酶活性和5’→3’外切酶活性，以3’外切酶活性迅