基于时间点的转录组综合分析鉴定斑马鱼下颌再生的调节通路-生物学专业论文.docxVIP

万方数据 万方数据 上海海洋大学硕士学位论文 答辩委员会成员名单 姓名 工作单位 职称 备注 金颖 上海交通大学/中科院 健康所 教授/研究员 主席 潘迎捷 上海建桥学院 教授 委员 胡以平 第二军医大学 教授 委员 朱淮民 第二军医大学 教授 委员 邹曙明 上海海洋大学 教授 委员 范纯新 上海海洋大学 讲师 讲师 答辩地点 水产与生命学院 B102 答辩日期 5 月 24 日 上海海 上海海洋大学硕士学位论文 基于时间点的转录组综合分析鉴定斑马鱼 下颌再生的调节通路 摘要 组织再生一直是许多生物研究者所研究的重要课题，实现组织和器官的再生 也是人类长久以来的梦想。如今再生医学越来越关注于干细胞为基础的再生治疗， 最吸引人的策略是能够把可用的细胞转化为需要的细胞类型。为了实现这个目标， 需要了解低等动物相应组织的再生过程中的分子调控机制，来为定向诱导干细胞 分化、组织原位诱导再生等提供理论支持。 斑马鱼(Danio rerio)具有很强的再生能力，之前的研究表明斑马鱼下颌剪去 1/3 后能完全再生，其再生方式是通过形成芽基这个中间过程来完成再生。再生的基 本过程与以前报道大体相似：在切除约 1/3 下颌后 1-2 天，创面形成较完整的愈伤 表皮，3-4 天出现大量的间充质细胞样的梭形细胞即芽基细胞，第 5 天开始芽基细 胞形态和极性与邻近的组织细胞十分相似，并逐步分化成各种组织，在 2 个月内 完成完全再生。所以确定了剪切后 1 周内是下颌再生的关键时间段，并确定了四 个再生的关键时间点：剪切前（uncut），再生愈伤上皮起始（2hpa），芽基形成起 始（2dpa），芽基再分化起始（5dpa）。但并不清楚下颌再生关键时间点的基因的表 达情况，它们是怎样调控再生的进行以及细胞的转化情况。本研究将进一步阐明 斑马鱼下颌芽基再生过程中-细胞和分子间的相互作用。 通过组织学观察发现剪去的 1/3 下颌包含了表皮、真皮、下颌骨的前部、下颌 骨连接处和一部分肌肉。剪切后 24h，新形成的表皮由表层和中间过渡型细胞构成， 中间过渡型细胞表现为核固缩、胞质减少或空泡化，其形态介于间充质细胞/有核 血细胞和表皮细胞之间。所以我们认为完整的再生表皮涉及外胚层和中胚层来源 的细胞的类型转变。 为了揭示芽基再生的再生因子和构建机理，我们对四个再生关键时间点进行 了转录组测序分析，分别为剪切前（uncut）、愈伤表皮激发（2hpa）、芽基形成起 始（2dpa）和芽基重塑（5dpa）。通过差异基因表达分析，发现总共有 5118 个基因 在这四个时期内发生了显著差异（q0.05）。除去 67 个基因在所有时期持续表达， 2hpa 与 0hpa 相比有 2800 个差异表达基因，2dpa 与 2hpa 相比有 533 个差异表达基 I 因，5dpa 与 2dpa 相比有 240 个差异表达基因。再生起始与维持经典的 10 条细胞 内信号通路 MAPK，ErbB，Wnt，Notch，Hedgehog，TGF-beta，VEGF，ECM-receptor interaction， Cell adhesion molecules 和 Jak-STAT 在斑马鱼下颌再生过程中也都存 在。但显著富集之后，只剩余 10 条中的 4 条涉及下颌再生，说明调控斑马鱼下颌 再生的机制是不同的，需要继续寻找下颌再生关键的信号通路。 通过 GO 富集和功能聚类分析，不仅确定了一些与 RNA 加工、转录调控、GTP 结合蛋白激酶、跨膜转运体、钙离子通道相关的 GO 条目，而且还发现有 10 个超 家族 Fox，Sox，Pax，POU，Six，Hox，Wnt，Bmp，Fgf 和 Collagen，共富集了 101 个差异基因，这些基因涉及诱导信号、芽基范围信号、组织特异信号、构造基 因。并且发现研究重点要关注于：氧化机制、血管新生、跨膜转运体、GTPase-酪 氨酸激酶激活、DNA 复制、神经嵴细胞的迁移、细胞分化、轴突的延伸、表皮和 肌肉发育的相关基因。 通 过 欧 氏 距 离 聚 类 分 析 ， 发 现 了 4 条 信 号 通 路 调 控 下 颌 再 生 ， 即 foxi1-foxo1b-pou3f1 ， pax3a-mant3a-col11/col2 ， pou5f1-cdx4-kdrl 和 isl1-wnt11 PCP-sox9a。而且这些信号通路都直接或间接的与 Rho-GTPase 和 MAPK 信号通路 有关。免疫组化和转基因鱼的实验结果显示，这些信号通路分别调控愈伤表皮形 成，细胞类型的转变，芽基血管的再生和软骨基质的定向。Foxi1-morpholino 敲降 Foxi1 会导致 Foxo1b 和 Pax3a 在基底层和芽基交汇处表达的区域扩大，也会影响 芽基血