医药基础-基因重组技术-51页.pptxVIP

1 3. 基因重组技术 2 3 基因重组技术3.1 概述3.1.1 定义 基因重组技术是一种在分子水平上按照人们设计的蓝图对基因进行人工操作的技术，具体地说，就是从一种细胞中把目的基因提取出来，在体外把它和一种载体分子连接，然后用人工的方法将这种杂种DNA分子引入到另一种细胞中去，让其大量复制繁殖或产生大量基因表达产物。 3 3 基因重组技术3.1 概述3.1.1 定义 别称： 基因工程（Gene engineering） DNA重组 (DNA recombination) 遗传工程 (Genetic engineering) 基因操作 (Gene manipulation) 基因克隆 (Gene cloning) 分子克隆 (Molecular cloning) … … 4 目的基因的分离； 重组载体的选择和制备； 目的基因与载体的重组； 重组体导入受体细胞； 重组克隆的筛选与鉴定； 目的基因在受体细胞中的表达及表达产物的分离纯化。 3 基因重组技术3.1 概述3.1.2 基因重组技术的主要内容和步骤 基因重组技术的主要内容 5 分离 重组 转化 表达 筛选 载体 基因重组技术的主要步骤 6 定义 是一类以环状或线性双链DNA为底物，能识别DNA中特定核苷酸序列，并在合适反应条件下使每条链的一个磷酸二酯键断开，产生具3’-OH和5’-P基团DNA片段的内脱氧核苷酸酶(endo-deoxyribonuclease)。 简称 限制性内切酶、限制酶、内切酶。 3 基因重组技术3.2 基因重组技术的工具酶3.2.1 限制性核酸内切酶(Restriction endonuclease)——分子剪刀 7 种类 目前，已从近300种不同的微生物分离出约500种限制性核酸内切酶。 类型（ 三种类型）  型酶、 型酶和  型酶。 若无说明，通常的限制性核酸内切酶就是指  型酶。 8 三种核酸限制性内切酶的主要特性比较 特 性 I 型酶 II 型酶 III 型酶 酶分子的结构与功能 三亚基多功能的酶 单一功能的酶 二亚基双功能酶 辅助因子 ATP、Mg2+、S-腺苷甲硫氨酸（SAM） Mg2+ ATP、Mg2+、S-腺苷甲硫氨酸 识别序列 特异性，非对称序列 特异性，旋转对称 特异性，非对称序列 切割位点 距特异性位点至少1000 bp处随机切割 在识别序列内部或附近特异切割 距识别序列下游2426bp处切割 在DNA克隆中的用途 无用 十分有用 有用 9 识别序列 定义 限制性核酸内切酶在双链DNA分子上能识别的特定核苷酸序列。又称为识别位点、靶位点或切割位点。 长度 4、5、6或7个核苷酸。 结构特点 具有双重旋转对称结构，即：回文结构（palindromic sequence）。 10 切割方式 已知大多数II型限制性核酸内切酶在其识别序列内部切割双链DNA，水解磷酸二酯键中的3’位的酯键，产生3’端为羟基、5’端为磷酸基团的片段。 切割后形成3种不同末端结构的DNA片段： 在识别序列的对称轴上同时切割，形成平头末端（blunt end），如Hae III； 在识别序列的双侧末端切割，若于对称轴的5’末端切割，可产生5’端突出的末端，如Eco RI； 在识别序列的双侧末端切割，若于对称轴的3’末端切割，可产生3’端突出的末端，如Pst I。 任何一种II型酶产生的两个突出末端，都能在适当温度下，退火互补，因此这种末端称为黏性末端（cohesive end）。 11 平头末端 5’ 粘性末端 3’ 粘性末端 12 限制性核酸内切酶在基因重组中的用途 1. 分割基因组DNA; 13 2. 获得分子重组所必需的末端； 限制性内切酶在基因工程中的用途 14 定义：能催化双链DNA分子中相邻的5’-P与3 ’-OH之间形成磷酸二酯键的酶。 活性：封闭缺口(nick)，不能封闭裂口(gap)。 3 基因重组技术3.2 基因重组技术的工具酶3.2.2 DNA连接酶（DNA ligase）——分子浆糊 15 两种DNA连接酶比较 DNA连接酶 T4 DNA连接酶 来源 大肠杆菌 大肠杆菌T4噬菌体 辅助因子 NAD+ ATP 功能 缺口（nick）修补 缺口修补和平头末端连接 16 T4 DNA连接酶在基因重组中的用途 补缺口 平头末端连接 粘性末端连接 17 磷酸二酯法合成寡核苷酸 磷酸三酯法合成寡核苷酸 固相亚磷酸三酯法合成寡核苷酸 3 基因重组技术3.3 目的基因的分离3.3.