医药基础-PCR(聚合酶链反应)-28页.pptxVIP

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2019-03-26 发布于贵州
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医药基础-PCR(聚合酶链反应)-28页.pptx

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PCR (Polymerase Chain Reaction) 聚合酶链反应目的：熟悉PCR技术的基本原理和操作历史 1983.4 Kary Mullis在开车前去北加利福尼亚红树县Redwood country的一条被月光笼罩的山路上构思了PCR 随后卖给了Roche公司价格：10.000$ 1993 Nobel prize PCR的基本原理变性、复性、半保留复制 PCR三步曲变性90～97℃退火45～55℃延伸72℃左右PCR过程一生二，二生四，四生万物 PCR引物设计一对引物，分别与5 ′和3′端互补长度：15～30个核苷酸引物内、引物间不应有互补序列引物与非特异扩增区无同源性PCR反应体系的五要素：引物、酶、dNTP、模板和Mg2+Taq DNA聚合酶来自水生栖热菌Thermusaquaticus 良好的耐热性 Mg2+依赖性无校读功能 PCR反应体系的准备 +Taq polymerase (Thermus aquaticus )+ nucleotides+ primers + salts (ions)+ DNA fragmentStep 1 : Denaturation 变性94°C TGAACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCATGACATCGATTTGATCGATACTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAGTACTGTAGCTAAACTAGCTAStep 2 : Annealing 退火T° primer-dependent TGAACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCATGACATCGATTTGATCGATGCTGCTACGTAGCGTAGTAGCAACTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAGTACTGTAGCTAAACTAGCTATaq PolymeraseTaq PolymeraseStep3 : Extension 延伸72°CTGAACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCATGACATCGATTTGATCGATGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAGTAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCCGTAGTAGCAACTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAGTACTGTAGCTAAACTAGCTANext step : Cooling You get two copies of your DNA TGAACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCATGACATCGATTTGATCGATACTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAGTACTGTAGCTAAACTAGCTATGAACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCATGACATCGATTTGATCGATACTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAGTACTGTAGCTAAACTAGCTAPCR ProcessProcess 变性退火延伸1 cycle2 cycle3 cycle加样器的使用模板的制备DNA从细胞中提取DNA：血细胞、绒毛、尿样、毛发、精斑、口腔上皮细胞固定和包埋的组织标本：脱蜡、蛋白酶K消化RNA新鲜组织或细胞所用器皿和试剂必需经高温灭菌或DEPC处理(一) 组织处理：取新鲜大鼠肝用预冷的生理盐水洗去表面血液，每克肝脏加2ml的裂解液，匀浆器中匀浆 PCR反应（一）引物： 5’ –TTTTCGTAGTAACGGAAGCC-3 ’ 5’ –TAAGGATTCTCAGATGCAAATG-3 ’ 引物的设计可以参照：两分钟StepByStep学会引物设计软件 Primer premier5.0/o