实验一 细菌转化.pptVIP

主讲人：王兴平 E－mail：nwsuafwxp@163.com 主讲人：王兴平 E－mail：nwsuafwxp@163.com 主讲人：王兴平 E-mail: nwsuafwxp@163.com 基因工程实验 细 菌 转 化 一、实验目的 感受态细胞的制备方法。 掌握质粒DNA转化感受态受体菌技术。 细 菌 转 化 二、实验原理 转化指用氯化钙处理宿主细胞（大肠杆菌JM109）,以利其将DNA重组子转入细胞内，在宿主细胞内进行增殖。 感受态细胞：即通过0.1M CaCl2处理细胞，增加膜对DNA的通透性，以增加细胞吸收外源DNA的效率，即细胞处于能摄入核酸分子时的生理状态。 三、实验器材、试剂 1.器材：旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml 微量离心管，双面微量离心管架，干式恒温气浴（或恒温水浴锅），制冰机，恒温摇床，培养皿（已铺好固体LB-Amp），超净工作台，酒精灯，玻璃涂棒，恒温培养箱。 2.试剂：30%甘油、0.1M CaCl2、氨卞青霉素（Amp）水溶液、X-gal、IPTG水溶液、LB培养液、含Amp的LB固体平板 。 四、感受态细胞的制备 复苏Ecoli JM110菌株，于LB平板上划线接种，37℃培养9-10h。 挑单菌落接种于300mL LB液体培养基（三角瓶）中，37℃振荡培养5-6h，（或者取原菌1:100加入到LB中，37℃振荡培养3-4h）使细胞处于对数生长期（用紫外分光光度计测定菌至OD600值达到0.4-0.5）。 分装6大管，每管50mL，冰上预冷30min，4000转，4℃离心5min。 弃上清，每管加10mL预冷至0℃的0.1M CaCl2（液体中有冰粒时效果最好），合为2管后，每管再补10mL 0.1M CaCl2至40mL，冰浴30min，4000转，4℃离心5min。 弃上清，每管加10mL预冷至0℃的0.1M CaCl2后，重悬菌体沉淀，合为1管，冰浴10-15min，即得感受态细胞。 四、感受态细胞的制备 现制现用，或加入20mL等体积的30%的灭菌甘油。 分装200管（每管200 ?l），投入液氮快速冷冻后，-70℃保存。 用标准质粒进行转化，若长出许多蓝斑菌落，证明感受态细胞的效价高。 四、感受态细胞的制备 取一支感受态细胞在冰上解冻后，将100?l感受态加入到10?l的连接产物中，混匀。 冰浴30min。 42℃水浴90sec（其间勿摇晃离心管）。 立即冰浴2min。 加入800?l LB液体培养基（不加Amp），于37℃，小于200rpm振荡培养1h以复苏细胞。 五、转化的操作步骤 给4?l IPTG和40?l X-gal充分混匀后用三角玻棒均匀地涂布于含100?g/mL Amp的LB选择性平板上，待液体被吸干即可用于涂布转化的细菌。 将复苏好的细胞3000转离心2min，丢上清800?l，轻柔地将细菌悬浮，涂板。 待液体完全渗入琼脂后，倒扣平板，于37℃温箱中培养10h以上。 取出置于4℃放置数h，重组子筛选。 五、转化的操作步骤