二第二章 基因工程制药 新版2教材编辑.pptVIP

第三节 基因工程制药生产的基本过程;一、工具酶的分离纯化;（一）基因工程制药所用到的工具酶;（二）关于限制酶;1、宿主限制现象;;E.coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶; R/M体系的作用： 保护自身的DNA不受限制； 破坏外源DNA使之迅速降解;※限制性内切酶本是微生物细胞中用于专门水解外源ＤＮＡ的一类酶，其功能是避免外源ＤＮＡ的干扰或噬菌体的感染，是细胞中的一种防御机制。 ※由于R/M现象的发现使得核酸内切酶成为基因工程重要的工具酶。;2、限制酶的定义;3、限制酶的特征;4、限制酶的作用;5、基因工程所用到的限制酶;6、影响限制酶作用的因素;（三）关于连接酶;二、基因工程载体的分离纯化;（一）定义;（二）基因工程载体的必备条件; （8）应具有灵活的克隆位点、并且有方便的筛选标记。（9）应具有很强的启动子。（10）应具有阻遏子，使启动子受到控制，因为外源基因的高效表达会抑制宿主细胞的生长、增殖，而阻遏子可使宿主细胞免受这种影响。（11）应具有很强的终止子，以便重点克隆外源基因区段，而不转录其它无关基因。（12）所产生的mRNA必须具有翻译的起始信号，即含有起始密码AUG和SD序列，以便转录之后能够顺利于进行翻译。 ;（三）基因工程载体的种类;1、细菌质粒;（1）质粒的定义;（2）质粒的特性;质粒的复制类型 ;质粒DNA的构型;单链切割;（3）质粒的分类;（4）质粒载体具备条件;（5）常用的细菌质粒;[A]、 pBR322质粒;pBR322:人工构建重要质粒 ;;pUC质粒优点： 　　１．具有更小的分子，更高的拷数 　　２．适于组织化学检测重组体． 　　;[C]、 pGEM-3Z质粒;2、真核基因病毒DNA;（1）病毒载体的优点;（2）已经研究的真核基因病毒DNA;[A]、SV40病毒DNA;（A1）、SV40病毒DNA的特性;（A2）、SV40病毒DNA的基因组;（A3）、SV40病毒DNA载体的构建;（A4）、SV40病毒DNA载体的使用方法;[G]、腺病毒;3、λ噬菌体DNA;（1）λ噬菌体DNA的特性;[A]、λ噬菌体DNA在宿主体内的生活方式;[B]、λ噬菌体DNA的结构;基因组长度：约为50kb的双链DNA分子，实际大小为48502bp。 DNA是线状双链分子带有单链的互补末端，末端长12个核苷酸，称为粘性末端（cos序列）。当噬菌体感染宿主细胞后，双链DNA分子通过cos而成环状。 61个基因，每个基因平均为1000bp，其中32个较为重要，它们的分布和排列与其功能有一定关系。 基因组分为二部分：（1）其中一半基因，控制着生命活动周期。（2）另一半基因，可被外源性目的基因所取代， 而不影响噬菌体的生命活动。;基因组分为几个不连续的区域，三个片段组成：;λ噬菌体基因组;（2）λ噬菌体DNA的改造;（3）λ噬菌体DNA的体外包装;[A]、体外包装的作用;[B]、λ噬菌体DNA包装的原理;（4）λ噬菌体载体的构建;（A） 缩短长度;插入型载体：;注意：λ噬菌载体作为载体，其重组噬菌体DNA大小只能： 37kb ~ 51kb。;置换型载体;特殊性质：中间区域约长18kb，这一段DNA可以被外源置换而不会影响λphage裂解生长的能力。 包装限制： λphage头部外壳蛋白容纳DNA能力上限≤105%，下限≥75%。包装范围[51kb, 36kb].只有λDNA的长度大于野生型λphage DNA长度的75％而不超过其105％时，才能被包装成phage颗粒，当DNA的长度短于野生型的75%或超过105%时，phage活性就急剧下降，故要求λ载体DNA和外源DNA长度之和在36～51kb之间。 λ载体必要区是28kb,理论上克隆能力为23kb. ;（B） 改造酶切位点;（C） 增加选择标记;加装选择标记 lacZ; ; ;4：单链DNA噬菌体M13载体;M13噬菌体的组成和结构;M13噬菌体的外型呈丝状;单链DNA，由6407碱基组成。 90%以上的序列可编码蛋白质，共有11个编码基因 基因间的间隔区多为几个碱基。较大的间隔位于基因Ⅷ/Ⅲ以及基因Ⅱ/Ⅳ之间，其间有调节基因表达和DNA合成的元件。;M13噬菌体的基因组; M13噬菌体载体的构建;⑤M13噬菌体在用作载体时是利用其双链状态的RF DNA：单链DNA的酶切和连接是比较困难的。 ⑥外源片段插入位点在基因Ⅱ和基因Ⅳ之间的508bp间隔区----M13不像λ噬菌体基因组那样含有较大的可替代区。它的基因组中绝大多数为必需基因，只有两个间隔区可用来插入外源DNA（基因Ⅱ/Ⅳ和基因Ⅷ/Ⅲ之间）。;5：人工质粒载体--科斯质粒;Cos质粒（考斯质粒 Cosmid）;[A]、科斯质粒的基本组成;柯斯质粒p