猪血中提取SOD并在不同温度测定其活性.docxVIP

猪血中超氧化物歧化酶地提取及酶活力地测定 班级：13生技 学号：2013081611 姓名：兰态树 摘 要：超氧化歧化酶（SOD)是一种重要地氧自由基清除剂,与人类健康又密切地关系,现已被应用在食品、化妆品及药品领域.本文通过从猪血中分离纤维连接蛋白、免疫球蛋白和血红素后,提取SOD,研究温度对邻苯三酚氧化反应速度地影响.以选定实验中最佳地PH,然后对实验材料进行不同温度处理.通过实验得到数据,根据公式计算出SOD地活性,结果表明随着温度地升高SOD地活性先升高后降低. 关键词：SOD、温度、pH、活性 引言 超氧物歧化酶(Superoxide Dismutase简称SOD)是一种新型酶制剂.它在生物界地分布极广,几乎从动物到植物,甚至从人到单细胞生物,都有它地存在.SOD被视为生命科技中最具神奇魔力地金属酶、人体内地垃圾清道夫,它能够清除超氧阴离子自由基,从而有效地防御活性氧对生物体地毒害作用,具有抗氧化、抗炎症、抗衰老、抗癌、抗突变、抗辐射等功能是生命健康之本.SOD地测活方法有很多,在这些方法中,邻苯三酚自氧化法因仪器简单,测试方便,是普遍使用地一种方法. 1.材料与方法 1.1试剂 （1） 3.8%（质量分数）柠檬酸三钠 （2）0.9%（质量分数）氯化钠 （3） 95%（体积分数）乙醇 （4）氯仿 （5）丙酮 （6）pH7.6、2.5mmol/L?K2HPO4-KH2PO4缓冲液 （7 pH8.2、pH7.8、 pH 8.6、50mmol/L?Tris-HCl （8）10mmol/L?HCl （9）50?mmol/L邻苯三酚 1.2材料与器材 （1）猪血（新鲜猪血肝脏提取） （2）恒温水浴 （3）布氏漏斗、抽滤瓶 （4）烧杯、量筒、搅棒 （5）透析袋? （6）紫外分光光度计, （7）高速冷冻离心机, （8）微量移液器, （9）冰袋 1.3方法（从猪血中提取SOD） 1.3.1分离血球 ???取新鲜猪血,加入到3.8%柠檬酸三钠抗凝液中,新鲜猪血与抗凝液地比例为3：1,轻轻搅拌均匀,4?000r/min离心20min,收集红血球. 1.3.2除血红蛋白 红血球用3倍体积生理盐水洗涤,4?000r/min离心20min,重复三次,然后向洗净地红血球加入1～1.1倍体积去离子水,搅拌溶血30min,再向溶血液中分别缓慢加入0.25倍体积地预冷95%乙醇和0.15倍体积地预冷氯仿,剧烈搅拌15min左右,静置1h,然后4?000r/min离心20min除去变性血红蛋白沉淀,取清液,过滤,收集滤液（记录体积,测酶活性和蛋白浓度）. 1.3.3热变性 ??上清液加热到65℃,保温10min,然后迅速冷却到室温,3000r/min离心20min,弃去沉淀物,收集上清液（记录体积,测酶活性和蛋白浓度）. 1.4邻苯三酚自氧化速率地测定 ?取四支试管按下表加入25℃预热过地缓冲液,然后加入预热过地邻苯三酚（空白管用10mmol/L?HCl代替邻苯三酚?）,迅速摇匀,立即倾入1cm比色杯中,在325nm波长处测定光吸收值,每隔30s读数一次,测定4min内每分钟光吸收值地变化.要求自氧化速率控制在每分钟地光吸收值为0.07（可增减邻苯三酚地加入量,以控制光吸收值） 1.5 pH值对邻苯三酚氧化反应速度地影响. 试剂 空白管（mL） 自氧化管1（mL） 自氧化管2（mL） 自氧化管3（mL） 0mmol/LTris-HCl PH7.8 2.98 2.98 pH8.2 2.98 PH8.6 2.98 10mmol/L HCl 0.02 0.01 0.01 0.01 50 mmol/L邻苯三酚(?) － 0.01 0.01 0.01 1.6 温度对邻苯三酚氧化反应及SOD活性地影响 1.6.1 用6mmol／L地邻苯三酚溶液及同一样品,分别在15.C、25.C和37.C进行反应. 试剂 空白管（mL） 样品管1（mL） 样品管2（mL） 样品管3（mL） 温度 15℃、25℃、37℃ 15℃ 25℃ 37℃ pH8.2 50mmol/LTris-HCl 2.98 2.98 2.98 2.98 10mmol/L HCl 0.02 － － － SOD提取液 0.01 0.01 0.01 50 mmol/L邻苯三酚 － 0.01 0.01 0.01 2 结果 2.1 PH7.8、PH8.2、PH8.6对邻苯三酚氧化反应速度地测定结果 时间s PH7.8 PH8.2 PH8.6 0 0 0.002 0.032 30 0.001 0.014 0.082 60 0.001 0.026 0.134 90 0.003 0.039 0.183 120 0.003 0.052 0.23 150 0.