马铃薯S病毒外壳蛋白的原核表达与其多克隆抗体的制备.pdfVIP

青岛农业人学硕十学f节论文 摘要 本研究的目的是构建马铃薯s病毒(PVS)外壳蛋白(CP)基因的原核表达载体， 实现其高效表达，用表达产物作抗原制备抗血清，迸一步获得纯化的抗体(IgG)与酶 连接，连接物转化受体茸TDP010获碍了Amp抗性茸落。经质拉电泳检测、FstI与跏I 的单酶切和双酶切鉴定，筛选到了PVS-CP基固正向插入载体的阳性克隆，相应的重组 入我体的方向正确、密码子的阅读正确，即成功构建了PVS—CP基因的原核表达载体。 融合蛋白。诱导研究表明在SOB培养基中融合蛋白的表达量高于LB培养基，经优化的 表达条件为：37℃，在SOB培养基中用0．2％阿拉伯糖诱导4h。光密度扫描结果表明该 融合蛋白在细菌总蛋白中占的比例为27％。 用溶菌酶裂解菌体，提取细菌总蛋白，SDS显示表达的融合蛋白主要以包涵体 的形式存在。用8M尿素容解包涵体，经镍离子亲和层析纯化，获得了高纯度的目的蛋 白。对纯化后的变性蛋白进行了透析复性与柱上复性处理，获得了两种复性蛋白。 分别用纯化得到的变性蛋白、透析复性获得的蛋白与柱上复性获得的蛋白作抗原免 疫家免，制备出了抗血清。琼脂糖双向扩散显示三种抗血清与抗原(融合蛋白)均能形 成呱显的沉淀线，即获得了该蛋白的特异性抗血清，用变性蛋白制备的抗血清的效价为 和1：6400，而变性蛋白抗血清的效价为1：1600。两种测定方法的结果都表明复性蛋白抗 血清的放价高于变性蛋白的抗血清。 先用饱和(NH。)，SO。进行盐析，然后用ProteinG亲和层析柱纯化，获得了高纯度抗 体(IgG)。用戊二醛一步法对纯化的抗体进行标记，获得了IgG的碱性磷酸酶标记物。 性，健康的幼苗则呈阴性，结果表明获得了PVS的特异性多克隆抗体与酶标记抗体。 奠定了基础。 关键词：马钤薯s病毒；筇壳蛋白基因：原核表达；多克隆抗体割备；弘s—ELIsA 壹墨坐些叁鲎堡±堂!兰堡塞 垒!唑 Abstract of virus forits This istoconstruct vector research expression potato S(Pvs)CPgone prokaryotic as isto thefusion furtherresearch in叵coliand antiserum expression prepare using proteinantigen．The withalkaline detectPVSDAS_ELISA— fromantiserum，labelthe bY lgG lgG phosphatase(AP)and purify WaSrecoveredUltrafree-DAkitand into PCR ofPVS—CP using ligated Specificproduct gone into TOPO10． vector therecombinantwagtransformedEcolt