微生物学实验教案-新乡医学院理论课教案首页.docVIP

新乡医学院实验课教案首页 课程名称：微生物学 授课教师姓名及职称：丰慧根 教授 一、授课题目 实验一 细菌的简单染色和革兰氏染色 二、授课对象 2005级生物技术专业本科生 三、实验教学目标与课时分配 1、学习微生物涂片、染色的操作技术； 2、掌握细菌单染色和革兰氏染色的方法； 3、初步掌握无菌操作技术； 4、掌握革兰氏染色反应原理、操作步骤和意义。 3课时 四、授课重点 1、微生物涂片、染色的基本技术； 2、无菌操作技术 五、授课难点 1、微生物涂片、染色的基本技术； 2、无菌操作技术 六、授课形式 实验课讲授 七、授课方法与课前准备 授课方法：启发式教学，讨论式教学； 课前准备：做预实验，准备示教材料，写教案 八、教材与参考文献 沈萍、范秀荣、李广武主编。《微生物学实验（第三版）》，高等教育出版社。 九、思考题 1．你认为哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？ 2．当你对一株未知菌进行革兰氏染色时，怎样能确证你的染色技术操作正确，结果可靠？ 十、教研室主任 及课程负责人签字 教研室主任（签字） 课程负责人（签字） 年 月 日 年 月 日 新乡医学院实验课教案 课程名称： 微生物学 任课教师：丰慧根 教授 基本内容 教学手段和教学 组织 细菌的简单染色和革兰氏染色 一、实验目的 1、学习微生物涂片、染色的操作技术； 2、掌握细菌单染色和革兰氏染色的方法； 3、初步掌握无菌操作技术； 4、掌握革兰氏染色反应原理、操作步骤和意义。 二、实验内容和原理 细菌的涂片和染色是微生物学实验中的一项基本技术。细菌个体微小，且较透明，必须借助染色法使菌体着色，与背景形成鲜明的对比，以便在显微镜下进行观察。此法操作简便，适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。 用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料（如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色。酸性染料的离子带负电荷，能与带正电荷的物质结合。当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。中性染料是前两者的结合物又称复合染料，如伊红美蓝、伊红天青等。 根据实验目的不同，可分为简单染色法、鉴别染色法和特殊染色法等，本实验主要做前面两种。 （一）简单染色法原理： 这是最基本的染色法，由于细菌在中性环境下一般带负电荷，所以通常采用一种碱性染料如美蓝、碱性复红、结晶紫进行染色。简单染色法是只用一种染料使细菌着色以显示其形态，简单染色不能辨别细菌细胞的构造。 （二）革兰氏染色法原理 革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。革兰氏染色法是细菌学上最常用的鉴别染色法，因为通过此法染色，可将细菌鉴别为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）两大类。 革兰氏染色过程所用四种不同溶液和作用： 1、碱性染料：这在简单染色中已讨论过，此处用结晶紫。 2、媒染剂：其作用是增强染料与细菌的亲和力，更好地加强染料与细胞的结合。常用的媒染剂是碘液。 3、脱色剂：帮助染料从被染色的细胞中脱色。利用细菌对染料脱色的难易程度不同，而将细菌加以区分。革兰氏阳性细菌不易被脱色剂脱色，而革兰氏阴性细菌则易被脱色。常用的脱色剂是丙酮或乙醇，这里所用的是95%的乙醇。 4、复染液：也是一种碱性染料，目的是使脱色的细菌重新染上另一种颜色，以便与未脱色菌进行比较。这里用的是蕃红花红溶液。 近年来由于对细菌细胞壁的结构有了较深入的了解，对革兰氏染色的机制提出不同的看法。一般认为革兰氏阳性细菌的肽聚糖层较厚，经乙醇处理后使之发生脱水作用而使孔径缩小，结晶紫与碘的复合物保留在细胞内而不被脱色；而革兰氏阴性细菌的肽聚糖层很薄，脂肪含量高，经乙醇处理后部份细胞壁可能被溶解并改变其组织状态，细胞壁孔径大，不能阻止溶剂透入，因而将结晶紫与碘的复合物洗去而被脱色。虽然如此，革兰氏染色的差异并不能完全认为是化学的差别，也有物理结构不同的结果，因为酵母菌细胞壁的成份完全和细菌不同，但具有革兰氏染色阳性反应。 三、实验器材 1、活材料：培养12-16h的枯草杆菌（Bacillus subtilis），培养24小时的大肠杆菌（Escherichia coli） 2、染色液和试剂：草酸铵结晶紫染液、卢哥氏碘液、95%酒精、蕃红染液、复红、乙醚酒精溶液、香柏油、无菌水 3、器材：废液缸、洗瓶、载玻片、接种杯、酒精灯、擦镜纸、显微镜等。 四、实验方法 1、简单染色： （1）涂片：取干净载玻片一块，在载玻