血红蛋白的提取和分离(试用版).pptVIP

初次离心后的结果 3次洗涤后的结果 利用透析袋透析 开始进行层析 收集得到的纯化后的蛋白 教学反馈 1．凝胶色谱法是根据（ ）分离蛋白质的有效方法。 A分子的大小 B相对分子质量的大小 C带电荷的多少 D溶解度 2．缓冲液的作用是：在一定范围内，抵制外界的影响来维持（ ）基本不变。 A温度 B pH C渗透压 D氧气浓度 3．电泳是指带电粒子在电场的作用下向着与其所带电荷（ ）的电极移动。 A相同 B相反 C相对 D相向 4. 哺乳动物和人的成熟的红细胞中的（ ）与氧气的运输有关。 A血红蛋白 B肌红蛋白 C肌动蛋白 D肌球蛋白 5．血液由血浆和各种血细胞组成，其中（ ）的含量最多。 A白细胞 B血小板 C红细胞 D淋巴细胞 6．为防止血液凝固，在采血容器中要预先加入抗凝血剂（ ）。 A. NaCl B.甲苯 C.蒸馏水 D.柠檬酸钠 7．将搅拌好的混合液转移到离心管中，离心后，可以明显看到试管中的溶液分为4层， 其中第3层是（ ） A无色透明的甲苯层 B脂溶性物质的沉淀层 C血红蛋白的水溶液 D其他杂质的暗红色沉淀物 取1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/l的磷酸缓冲液中（pH为7.0），透析12小时 (5)透析 除去样品中分子量较小的杂质 ①过程 ②透析目的 2、凝胶色谱 （1）凝胶色谱柱的制作 ①取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平 ②底塞的制作： 打孔 挖出凹穴 安装移液管头部 覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端 底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底 注意事项： ⑤安装其他附属结构 ③顶塞的制作 打孔 安装玻璃管 ④组装 将上述三者按相应位置组装成一个整体 （2）凝胶色谱柱的装填 ①凝胶的选择 A、材料 “G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围 75表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5克 B、代表意义： 交联葡聚糖凝胶（G-75） 配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液 ②凝胶的前处理 ③凝胶色谱柱的装填方法 A、固定 B、装填 将色谱柱处置固定在支架上 将凝胶悬浮液一次性的装填入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀 注意： 2、装填凝胶柱时不得气泡存在： 因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果 1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙 1、液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果 注意： 2、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象 装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在50cm 高的操作压下，用300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液（pH为7.0）充分洗涤平衡12小时 ④洗涤平衡 （3）样品加入与洗脱 ①调节缓冲液面 ②滴加透析样品 吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面 打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐关闭出口 ③样品渗入凝胶床 ④洗脱 加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口 小心加入pH为7的20mmol/l的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱 ⑤收集： 待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5ml一试管，连续收集（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功） 讨论： 答：让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持结构和功能 ⑥注意：正确的加样操作 1、不要触及破坏凝胶面 2、贴壁加样 3、使吸管管口沿管壁环绕移动 1、在血红蛋白的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的目的是什么？ 2、与其他真核细胞相比，红细胞有什么特点？这一特点对你进行蛋白质得分离有什么意义？ 答：血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。 思考：在血红蛋白整个实验室中用的缓冲液是什么？它的目的是什么？ 使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细胞内