3 Geneup生物技术有限公司产品目录Cas9 V2 25.pdfVIP

Geneup生物技术有限公司产品目录 第三类 CRISPR/Cas9系列 CRISPR/Cas9 CRISPR/Cas9 一、CCRRIISSPPRR//CCaass99技术简介 CRISPR/Cas9（Clustered Regularly Interspaced Short PalindromicRepeats）是 来自细菌及古细菌的一套特异性免疫系统。在该系统中，crRNA（CRISPR-derived RNA）与tracrRNA（trans-activatingRNA）结合形成的复合物能特异性识别靶基 因序列，并引导Cas9核酸内切酶在靶定位点剪切双链DNA，从而达到对目的基 因组DNA进行特异性编辑。自2013 年1 月首次报道利用CRISPR/Cas9 系统可 以对哺乳动物细胞进行基因组改造以来，CRISPR/Cas9系统高效的基因组编辑功 能已被应用于多种模式生物，包括人、小鼠、大鼠、斑马鱼、秀丽隐杆线虫、植 物及细菌。研究表明，与锌指核酸酶（ZFNs）和转录激活样效应核酸酶 （Transcription activator-like effector nucleases,TALEN）相比较，CRISPR-Cas 系 统介导的基因组靶向实验在细胞或动物中具有相似甚至更高的效率。 图1：CRISPR/Cas9 技术编辑基因原理示意图 CRISPR/Cas9 CRISPR/Cas9 二、利用CCRRIISSPPRR//CCaass99技术进行基因敲除的优点 1. 可实现多个靶基因位点及多个基因的同时敲除； 2.RNA导向的基因组DNA识别，无需考虑DNA甲基化； 3. 无种属限制，适用于各种细胞系的靶向敲除； 4. 系统灵活简单，敲除效率更高。 Geneup Cas9 Geneup Cas9 三、GGeenneeuupp公司研发的CCaass99相关产品及服务 （一）诱导型Cas9/Cas9n过表达慢病毒载体 (pLVi-503，pLVi-504) 载体特点： � 使用改良的四环素反应元件（TRE3G）和反义四环素转录激活子（TETON3G） 并反向克隆到同一慢病毒载体，显著提高了诱导效果，并降低了本底，在非 诱导条件下几乎检测不到“泄漏”的人源化Cas9蛋白； � 加入药物Dox 时，TETON3G 与其结合后发生构象改变并结合到TRE3G 位 点，从而促使miniCMV启动子控制下的Cas9或者Cas9n的表达； � 含有嘌呤霉素（puromycin）抗性筛选基因，可筛选稳定表达细胞系； � 既可用瞬时转染，也可包装成慢病毒后感染细胞； � 与第四代慢病毒包装质粒匹配，可制备高滴度慢病毒颗粒。 载体图谱： Cas9 Cas9 为什么要选择诱导型CCaass99表达体系？ 利用Cas9 技术可以进行高通量筛选，现有的做法是在Cas9稳转细胞系上进行操作。研 究表明，Cas9的持续表达对细胞会产生一定的毒性，因此我们开发了诱导型Cas9过表达慢 病毒载体，可以方便地构建稳转细胞系。当对细胞转染过表达sgRNA的载体或者体外合成 的sgRNA 时，加Dox便可诱导Cas9表达并启动对靶DNA的编辑，一旦剪切筛选任务结束， 更换为不含Dox的培养液，便可有效避免由于Cas9持续表达对细胞造成的各种毒副作用。 （二）sgRNA过表达慢病毒载体 1.pLVc-502(pLVc/U6.sgRNA-copGFP-Puro) 载体特点： � 使用人U6启动子表达sgRNA序列； � 用BsmB1 酶切载体，与crRNA插入片段连接； � 含有copGFP标记基因，可以实时跟踪转染效率； � 含有嘌呤霉素（puromycin）抗性筛选基因，可筛选稳定表达细胞系； � 既可用于瞬时转染，也可包装成慢病毒后感染细胞； � 设计crRNA插入片段的引物结构为 上游引物： 5`-ACCG NNNN NNNNNNNNNN NNNNN-3’ 下游引物： 3`- NNNNNNNNN NNNNN NNNNNCAAA-5’ 2.pLVc-505(pLVc/U6.sgRNA