海洋微生物来源吲哚酮纤溶化合物影响纤溶因子构象特性的研究-食品科学与工程专业论文.docxVIP

上海海洋大学硕士学位论文 上海海洋大学硕士学位论文 万方数据 万方数据 海洋微生物来源吲哚酮纤溶化合促进纤溶作用的机理研究 摘 要 2,5-二((2-(2,6-二甲基-2,6-二烯)壬基)-(2-甲基-3-羟基)-吡喃并(5-羟 基)-异吲哚酮基)-戊酸(2,5-Bis-[8-(4,8-dimethyl-nona-3,7-dienyl)-5 ,7- dihydroxy-8-methyl-3-keto-1,2,7,8-tertahydro-6H-pyran[a]isoindol-2-yl]-p entanoic acid，FGFC1)是从海洋真菌长孢葡萄穗霉 FG216(Stachybotrys longispora 216)的代谢产物中分离出的海洋天然产物，属于吡喃并异吲 哚酮类生物碱。研究发现，在体外溶栓体系中，随着 FGFC1 浓度增加， 对于纤维蛋白有明显的降解作用；在体外溶栓大鼠肺栓塞模型中，添 加 5mg/kg 以上的 FGFC1 能使肺血栓彻底溶解，且 FGFC1 溶栓的安全 性通过大鼠血液纤维蛋白原和 FDP 的含量不随 FGFC1 的加入而变化证 实；通过对 FGFC1 产物进行优化，其发酵产量得到大幅度提升，是潜 在的优良溶栓药物，故研究 FGFC1 促进血栓溶解的机理具有重要意义。 本论文通过聚丙烯酰胺凝胶电泳法（SDS）及发色底物法研究 FGFC1 在单链尿激酶型纤溶酶原激活剂和纤溶酶原构成的相互活化反 应体系中的作用，应用圆二色谱法（CD）研究 FGFC1 对纤溶活性因 子空间结构的影响，运用发色底物法研究纤溶酶原激活剂激活纤溶酶 原的酶促反应动力学，探究 FGFC1 对纤溶作用的促进机制。 第一章总结了纤溶系统的组成部分纤溶酶原、纤溶酶原激活剂、纤 I 溶酶原激活剂的抑制剂、纤溶酶抑制剂的分子结构及功能特性；阐述 了圆二色谱法的作用机理及其在小分子与蛋白质相互作用的应用；总 结了酶促动力学的相关理论基础及其在溶血栓药物机理探究中的相关 方法及应用。 第二章用聚丙烯酰胺凝胶电泳法（SDS）和发色底物法研究 FGFC1 在单链尿激酶型纤溶酶原激活剂和纤溶酶原构成的相互活化反 应体系中的作用，从而探究 FGFC1 促进纤溶作用的机制。在体外构筑 的纤溶反应体系中，SDS的结果显示 FGFC1 的加入促进 FITC- 纤维蛋白原的降解，发色底物法结果证明加入 FGFC1 后体系中尿激酶 及纤溶酶的含量增多，这些结果表明 FGFC1 加速纤溶酶原和单链尿激 酶型纤溶酶原的相互活化作用。 第三章应用圆二色谱法（CD）研究 FGFC1 对纤溶活性因子空间结 构的影响。远紫外区的 CD 结果表明：FGFC1 在 23 μmol·L-1~115 μmol·L-1 的浓度范围内，促使单链尿激酶型纤溶酶原激活剂的 α-螺旋向 无规卷曲转化，促使尿激酶型纤溶酶原激活剂的 α-螺旋向无规卷曲转 化，促使纤溶酶原的 β-折叠向无规卷曲转化，促使纤溶酶的 β-折叠向 无规卷曲和 β-转角转化，这些酶的二级结构的变化都导致酶分子柔性 增加、更易发生反应；近紫外区的 CD 结果表明，FGFC1 使纤溶酶原 在 285 nm 处的摩尔旋光度增大。CD 研究结果表明 FGFC1 对单链尿激 酶型纤溶酶原激活剂和尿激酶型纤溶酶原激活剂结构的影响较为微 弱，对纤溶酶及纤溶酶原结构的影响复杂而深刻。从 CD 的研究结果 II 能够判断 FGFC1 作用于纤溶酶（原）并辅以改变单链尿激酶型纤溶酶 原激活剂的二级结构发挥促进纤溶过程的作用。 第四章运用发色底物法研究激活纤溶酶原的酶促反应动力学,在纤溶 酶原激活剂激活纤溶酶原反应体系，随着 FGFC1 浓度的增加，Kcat 的 值显著增加，40μg·mL-1 的 FGFC1 提高单链尿激酶型纤溶酶原激活剂 激活纤溶酶原的 Kcat 增大 26.5 倍，这意味着 FGFC1 显著提高了单链尿 激酶型纤溶酶原激活剂的最大催化效率；随着 FGFC1 浓度的增加， 40μg·mL-1 的 FGFC1 提高单链尿激酶型纤溶酶原激活剂激活纤溶酶原 的 kcat/km 的增大了 22.8 倍，这表明 FGFC1 大大提高了单链尿激酶性 纤溶酶原激活剂的总体催化活性。随 FGFC1 浓度的增大反应的 Km 值 略有上升，这表明 FGFC1 较为微弱的降低了单链尿激酶性纤溶酶原激 活剂对纤溶酶原的亲和活性。 在纤溶酶原和单链尿激酶性纤溶酶原激活剂反应体系，单链尿激酶 性纤溶酶原激活剂的活性中心与纤溶酶原的 K5 附近的 Arg560-Val561 相 作用，单链尿激酶性纤溶酶原激活剂通过类似于尿激酶活性的内因性 活性将纤溶酶原的 Arg560-Val561 断裂，FGFC1 促进了单链尿激酶型纤溶 酶原激活剂转