广藿香无菌苗的秋水仙素和EMS诱变及突变体植株遗传多样性的ISSR分析-种质资源学专业论文.docxVIP

litrllIflrlIIIllIllJIIY1933015海南大学学位论文原创性声骺Jf-ntE用授权说明原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的作品或成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律结果由本人承担。论文作者签名：嘧执日期：2-ot／年石月孕日学位论文版权使用授权说明本人完全了解海南大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权海南大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本人在导师指导下完成的论文成果，知识产权归属海南大学。．．保密论文在解密后遵守此规定。论文作者签名：营岛嘭b导师签名：溷沁日期：zDIf年6月8日日期：必(月彤日∥文提交“CALIS高校学位论文全文数据库”中全文发布，并可按“章程”中规定享受相关权益。园童途塞埕銮卮澄厦：旦圭生；旦=生i旺生蕉查。∥垅，a9论文储躲鞴％导师签名历f例@日期：加I／年6月留日日期：抽“年‘6月缪日麓《摘要广藿香(Pogostemoncablin)是我国重要常用中药之一；原产于菲律宾、马来西亚和印度等国家，后传入我国。广藿香在我国产区栽培，由于气温比原产地低，罕见开花，因此生产上一直采用扦插繁殖。在长期栽培过程中，病原体通过无性繁殖传递，故造成品种退化，病虫危害加霞。为了确保广藿香这一重要中药种类的生存和发展，解决问题的措施之一是引入新的育种技术和方法以尽快培育出新品种。本研究以广藿香的无菌丛生芽为实验材料，使用秋水仙素和EMS进行诱变处理，并对突变体植株材料的遗传多样性，以及外植体材料的原初供体与突变体植株相互之间的遗传变异进行ISSR分析。本研究的主要实验结果如下：1．以广藿香幼嫩叶片为外植体，通过愈伤组织诱导途经得到大量丛生芽。将丛生芽转接到含有不同浓度6-BA的增殖培养基和不同浓度IBA的生根培养基中，分别筛选出最适增殖培养基为：MS+0．1mg／kD．2mg／L6．BA，最适生根培养基为1／2MS+O．25mg／L～1．0mg／LIBA。以在MS+0．1mg／L6-BA培养基增殖的丛生芽为实验材料，用不同浓度化学诱变剂秋水仙素和甲基磺酸乙酯(EMS)处理不同时问，最终得到出广‘藿香丛生芽的半致死剂韪分别为：0．2％秋水仙素处理3d；以EMS为化学诱变剂时，半致死剂景为1．2％EMS处理7．5h。2．为了建立广藿香ISSR-PCR的优化反应体系，本研究首先通过单因素试验选定其各影响凶子比较适宜的浓度范围，再利用正交试验设计的方法，对影响广藿香ISSR．PCR反应的5种因素4水平进行优化试验。广藿香ISSRoPCR的优化反应体系最终确定为：在25此反应体系中，DNA模板40ng，M92+2．5mmol／L，引物浓度为O．3wml／L，Taq聚合酶浓度为1．5U，dNTPs浓度为150p,mol／L。PCR扩增程序为：94℃预变性5min，然后按94℃变性45s，50．9～58．1℃退火45s，72℃延伸90s，进行40个循环，最后72℃延伸7min；4℃保存。利用优化后的反应体系和PCR扩增程序，根据所购引物的理论退火温度，设计了6个退火温度梯度对所购60个引物进行退火温度筛选，最终筛选出12个条带丰富、清晰且稳定的引物并确定了其最适退火温度。3．使用广藿香丛生芽的秋水仙素和EMS半致死剂量分别处理100多个丛生芽，最终获得7l份秋水仙素诱变植株和62份EMS诱变植株，然后使用筛选出的12条ISSR有效引物分别对两类不同类型的诱变材料和一份原始供体植株材料(CK)进行ISSR扩增，并对诱变后植株的表形进行观察。结果发现：秋水仙素诱变后的植株矮化粗壮，分枝有所增多，但是通过ISSR遗传多样性分析表明诱变后植株遗传相似系数较大，遗传距离较小；EMS诱变后的植株大部分未发生表形变异，只有个别诱变植株的叶片形状、颜色等发生变化。经ISSR遗传多样性分析表明，相比秋水仙素诱变植株，EMS诱变植株遗传相似系数相对较小，遗传距离较大。这说明经EMS诱变的材料在DNA分子水平上发生了较大的变异。作者认为，这一现象可能与EMS多引起突变多为点突变，而秋水仙素所引起的突变则多数是由于染色体倍性的改变的遗传之变异机理有关。关键词：广藿香；丛生芽；秋水仙素；EMS；ISSR；遗传多样性ⅡAbstractPogostemoncablinwasoneoftheimportanttraditionalChinesemedicines．Itwasdistributedi