过表达大鼠ACE细胞模型的建立与ACE抑制剂筛选模型的研究-药理学专业论文.docxVIP

Ningxia Medical University Thesis for Application of Master’s Degree Establishment of cell model over-expression rat ACE and study on preliminary screening of ACE inhibitors Student’s Name: Ma Lin Supervisor： Tan Huanran Subject Category: Medical science Major: Pharmacology Specialty: Moleculepharmacology School: School of Basic Medical Science Completion Date: Mar.2011 宁夏医科大学学位论文独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是个人在导师的指导下，独立 进行研究工作所取得的成果，无抄袭及编造行为。除文中已经特别加以 注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过 的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以 明确方式标明并致谢。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 论文作者签名＿＿＿＿＿ 论文导师签名＿＿＿＿＿ 年 月 日 年 月 日 宁夏医科大学关于学位论文使用授权的声明 宁夏医科大学有权保留使用本人学位论文，同意学校按规定向国家 有关部门机构送交论文的复印件和电子版，允许被查阅和借阅。本人授 权宁夏医科大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或其他复印手段保存和汇编本学位论文。 可以公布（包括刊登）论文的全部或部分内容。 （保密论文在解密后应遵守此规定） 论文作者签名＿＿＿＿＿ 论文导师签名＿＿＿＿＿ 年 月 日 年 月 日 I I 宁夏医科大学硕士研究生学位论文 中文摘要 过表达大鼠 ACE 细胞模型的建立与 ACE 抑制剂筛选模型的研究 中文摘要 目的 构建 pEGFP-ACE 真核表达载体，并利用 HepG2 细胞建立过表达大鼠血管紧张素转 化酶 I（Angiotensin I Converting Enzyme，ACE）的细胞模型，为血管紧张素转化酶 抑制剂（Angiotensin-converting enzyme inhibitors，ACEI）类药物的筛选提供研究 工具。 方法 ①pEGFP-ACE 真核表达载体的构建及鉴定：Trizol 法提取大鼠肺组织总 RNA，利 用 RT-PCR（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction）的方法得到 ACE cDNA， 回收纯化目的基因，并与质粒 pEGFP-C1 经 SalI 和 Acc65I 双酶切的产物在 T4 DNA 连接 酶的作用下连接，转化至感受态大肠杆菌 DH5α，在含有卡那霉素（30μg/ml）的 LB 琼脂平板上培养过夜，挑取和筛选阳性克隆。酶切鉴定后的阳性克隆进行测序，用 BLAST 软件与 GeneBank 数据库进行同源性分析。 ②HepG2 细胞的转染和重组大鼠 ACE 蛋白的表达及检测：提取的重组质粒 pEGFP-ACE，在 250V，20ms 的条件下电转染 HepG2 细胞。在转染 48h 后收集细胞，Western blot 鉴定重组 ACE 蛋白的表达情况；利用 pEGFP 载体的 G418 抗性，筛选出过表达 ACE 的细胞株。 ③ACE 活性的测定：利用马尿酰-组氨酰-亮氨酸（hippuryl–L–histidyl -L-leucine ，HHL)可在 ACE 的催化下迅速分解产生马尿酸(hippuric acid，HA)，以高 效液相色谱法(high-performance liquid chromatography，HPLC)测定反应液中的马尿 酸生成量来检测 ACE 的活性；利用血管紧张素转化酶抑制剂（Angiotensin-converting enzyme inhibitors，ACEI）类药物—卡托普利（captopril）对 ACE 活性的抑制作用对 所得细胞株进行检测。 结果 ①利用 RT-PCR 法成功获得大鼠 ACE cDNA，重组真核表达载体经 EcoRI 酶切鉴定、 测序及 BLAST 分析证实得到正确的重组 pEGFP-ACE 质粒。 ②电转染 HepG2 细胞 48h 后，Western blot 鉴定重组 ACE 蛋白在 HepG2 细胞中的 表达，在约 180KD 处出现条带，并筛选得到稳定表达 ACE 的细胞株。 ③利用 HPLC 法证实过表达 ACE 的细胞株对 HHL 的催化分解作用