HPLC方法建立和优化.ppt

梯度方法开发实例 - 第七步 最后用50-90%B，曲线4，得到好的结果。 6. 定性和定量分析 定性和定量方法的建立及论证 对方法的检测限、灵敏度、定量重复性、 偏差、回收率、样品的稳定性、方法的稳 定性、线性关系等求证。建立可靠的稳定 的分析方法 6.1 色谱峰定性 鉴别每个色谱峰 通过比较保留值(通常是保留时间)的方法，找到各色谱峰所对应的组份 大多数情况下用比较保留时间来定性 即所谓： 保留时间相同，可能是同样的组份 保留时间不同，肯定不是同样的组份 6.2 色谱峰的确认 用“标样”的保留值定出被测组份的位置 进一步的确认 Ⅰ标准加入 Ⅱ同时用其他方法 其他色谱方法（改变机理，如：用不同的色谱柱） 其他检测器 PDA，光谱图比较、谱库检索 MS，质谱图解析、谱库检索 其他仪器方法 6.3 定量分析的具体内容 确定样品的类型，主要成分/痕量成分 使分析条件的分离度（R）大于：1.5 色谱峰的定性，峰一致性测定 检测限及定量限：确定灵敏度及线性范围 用标样建立标准曲线 检查方法的准确度及精确度 用标样定期检查方法 6.4 痕量分析 如信/噪比不够，定量的精确度会受影响，因此要： 分析前浓缩样品 选择高灵敏度检测器 用衍生法 使色谱体系最优化 使用短的微径柱（减少样品的稀释） 使用高效色谱柱 使k值尽可能小 增加进样体积和浓度 使用低流速（N增加） 采用梯度淋洗 6.5 液相色谱定量精度的计算 测量精度的计算 6.6 常用的定量方法 峰面积百分比法 由于检测技术的影响，在液相色谱中不常用 外标法 在液相色谱中用的最多 内标法 准确，但是麻烦 在标准方法中用的最多 6.7 峰面积百分比法定量 公式： 特点： 各组分要全部流出、全部被检测，并对检测器的响应值一样简单，液相色谱目前很难做到这点 与进样量无关 不需标样 简单 6.8 外标法定量 配制一系列已知浓度的标样 外标法定量（二） 实际色谱图 外标法定量（三） 计算公式 特点 无需各组份都被检出、洗脱 需要标样 标样及样品测定的条件要一致 进样体积要准确 6.9 内标法定量（一） 配制一系列浓度的标样，其中加有内标样 内标法定量（二） 实际色谱图 标准曲线 内标法定量（三） 计算公式： 特点： 无需各组份都被检出、洗脱 需要标样，需要内标样 结果与进样体积无关 内标法定量（四） 对内标物的要求 化学结构与待测组分相似(同系物、异构体) 在样品中不存在 不与样品中组份发生任何化学反应 保留值与待测组分接近 浓度（响应值）与待测组分相当 其色谱峰与其他色谱峰分离好 6.10 定量校正曲线 曲线A： 因在零浓度时仍有色谱峰，可能有杂质未分开 曲线B： 在此浓度内，检测器的响应值是非线性的 曲线C： 可接受的理想状态，实际情况应是∶其延长线到零点 曲线D： 表明有样品的损失，可能是色谱柱的非特征吸附，也 可能是样品制备时的损失 7方法的完善：论证和移植 一个良好的论证方案，通常先进行那些重要的研究， 并预测将来的需要。 其次进行稳定性和普适性的全面研究（也就是移植）。 方法研究的各组成部分包括：准确度，精密度， 线性，范围，检测限，定量限，专属性。 7.1论证标准（一） 1.准确度 ：测定值和真值的接近程度。 以回收实验表示和确定；（1）与参比标准品比较；（2）被测物 的标准品加入法；（3）回收测定掺入空白基质中的被测物 2.精密度：重复该方法对均匀样品多次测定，各结果间 的一致程度。（1）重复性 （2）中间精密度 （3）重现性 3.线性：衡量响应值与浓度的校正曲线近似为一条直 线的程度。 4. 范围：方法有足够准确度，精密度和线性的最高和 最低浓度。 论证标准（二） 5.检测限和定量限：被认为是任何方法的论证的重要组成部分。 两者受分离条件的影响：色谱柱，试剂，尤其是仪器设备与数据系统。 6.专属性：大多数方法中最重要的指标：可定义为在其它物质存在的条件下可准确测定被测物浓度的能力。 确保专属性的步骤（1）掺入已知干扰物 （2）样品降解研究 （3）峰收集后，再用其它技术对其分析 （4） 使用另外的色谱分离模式