2、样品采集、储存与运输指南.docVIP

Version 201108 PAGE PAGE 7 / = sectionpages 7 7 地址: 上海市浦东新区张江高科技园区李冰路151号（201203） 地址: 上海市浦东新区张江高科技园区李冰路151号（201203） 电话: 021 传真: 021公司网站： HYPERLINK 客户服务热线： 8008205086 / 4008805086 《样本采集、储存与运输指南》 一、样本准备应该遵循的基本原则 代表性原则：取样的代表性关系到实验结果是否具有科学意义，因此您应该根据实验目的慎重选择您的取样方案。病变组织样本中应不夹带正常组织，正常组织样本中不能含有病变组织。有条件时，应做到实验组与对照组的样本在取材时间、部位、处理条件等方面尽可能保持一致，否则可能会影响实验结果的可信度。 准确性原则：代表性样本的各种特征数据必须被准确记录，并按要求（低温、迅速）采集、制备、贮存、运输，最终正确地按实验设计进行实验和数据处理。 迅速性原则：样本质量是影响表达谱芯片实验结果的最关键因素，因此用于表达谱芯片研究的样本，在采集、制备、贮存、运输过程中应尽可能地做到迅速，最大限度的缩短从样本采集到实验的时间。 低温原则：所取样本离体后，应立即置于液氮中，并保证在实验前始终处于-70℃以下，以避免RNA的降解。 二、样本采集(适于表达谱芯片及SNP芯片样本) 1.贴壁细胞 1）贴壁细胞培养诱导结束后，去除培养液； 2）加入适量的1xPBS缓冲液（PH~7.2）快速冲洗一次，彻底去除PBS缓冲液； 3）每10 cm2 细胞加1mL TRIzol或 Lysis/Binding Solution（AMBION）； 4）使用1mL移液器Tip头反复吹打细胞，直至细胞充分溶解至无絮状物； 5）将裂解液转移到RNase-free 的离心管中； 6）放入-80℃ 2.悬浮细胞 1）悬浮细胞培养诱导结束后，转至1.5 mL离心管中，3,000rpm离心5分钟去除培养液； 2）加入适量的1xPBS 缓冲液（PH~7.2）重悬细胞，3,000rpm离心5分钟去除PBS 缓冲液； 3）5×106细胞加1 mL TRIzol或102的细胞加300 μL Lysis/Binding Solution （AMBION）或102-107的细胞加600 μL Lysis/Binding Solution（AMBION），涡旋或使用1mL移液器Tip头反复吹打细胞直至细胞充分溶解至无絮状物； 4）放入-80℃ 3.细菌、酵母 1）溶菌酶或液氮冰冻研磨破壁； 2）按1×107细菌加1 mL TRIzol或Lysis/Binding Solution（AMBION），涡旋或使用1mL移液器Tip头反复吹打细胞直至细胞充分溶解至无絮状物； 3）放入-80℃ 4.血液（抽提DNA） 1）采集1-2mL全血,迅速转入EDTA抗凝管中； 2）颠倒抗凝管8-10次，充分混匀EDTA和全血，保证抗凝效果； 3）放入-20℃或-80℃ 5.血液（抽提RNA用于表达谱芯片，建议采用BD的PAXgene管抽取全血） ※PAXgene管法 1）采集2.5mL全血入PAXgene管中； 2）颠倒混匀8-10次，室温（18-25℃）放置2小时 3）放入-20℃或-80℃ ※EDTA抗凝管法 1）采集2-3mL全血,迅速转入EDTA抗凝管中； 2）颠倒抗凝管8-10次，充分混匀EDTA和全血，保证抗凝效果； 3）放入4℃冰箱中保存 以下两种方法有可能在操作过程对基因的表达产生影响： ※淋巴细胞分离液 1）在EDTA抗凝的新鲜全血中加入等体积1×PBS，充分混匀； 2）另取一新的离心管，加入与稀释血液等体积的淋巴细胞分离液，沿管壁缓慢将稀释血液加入到该离心管中，使稀释血液处于淋巴细胞分离液液面之上（即两种液体不要混合，保留清晰的界面），水平2000rpm（400g）离心30 min； 3）离心后，管内液体分为三层，上层为血浆和PBS，下层主要为红细胞和粒细胞。中层为淋巴细胞分离液，在中上层液面处有一白色云雾层狭窄带，即为富含淋巴细胞和单核细胞的单个核细胞(PBMC)及血小板； 4）吸去最上层的血浆，收集血浆层和淋巴细胞分离液交界面的单个核细胞，尽量全部吸出PBMC，移入一新的离心管中； 5）加入5倍1×PBS，混匀后离心200×g 10分钟，弃去上清液（低速离心有利于去除细胞悬液中留存的血小板）；通常每毫升外周血可得