红豆杉里紫杉醇的提取分离及分析1.docVIP

红豆杉里紫杉醇的提取分离及分析 实验材料与仪器 1.1 实验材料 新鲜红豆杉枝叶（树枝、树叶和树皮）。 1.2 实验试剂 主要试剂： 试剂名称 厂家 乙酸乙酯（分析纯） 北京化工厂 丙酮（分析纯） 北京化工厂 甲醇（分析纯） 北京化工厂 石油醚（分析纯） 北京化工厂 三氯甲烷（分析纯） 北京化工厂 二氯甲烷（分析纯） 北京化工厂 乙酸铵缓冲液（分析纯） 北京化工厂 乙腈（分析纯） 北京化工厂 去离子水（自制） 北京化工厂 紫杉醇标准品（纯度≧97%） 中国生物药监所 1.3 实验仪器 主要仪器： 仪器名称 厂家 XZ-6A 旋转蒸发器 北京科龙仪器公司 CFSJ-8A粉碎机 江苏瑰宝 JA 3003A电子天平 上海精天电子仪器有限公司 岛津LC-6A高效液相色谱仪 CQ-500超声波振荡器 常压层析系统 Pharmacia公司 实验试液制备 2.1 标准品溶液制备 准确称取紫杉醇（Taxol）标准品（纯度≧97%）5.00mg于50mL容量瓶，加入甲醇定容摇匀，配制成0.10mg/mL的标准溶液。用HPLC检测。 2.2 样品试液制备 采集新鲜红豆杉枝叶，清水洗净，于60℃烘箱内干燥至恒重，用粉碎机粉碎，过14目筛。 准确称取过筛后的样品5.00g于50mL广口具塞三角瓶内，加入50mL乙酸乙酯-丙酮混合液（体积比1:1，下同），超声萃取30min，取上清液。 沉淀再加50mL乙酸乙酯-丙酮混合液超声萃取30min，取上清液，合并两次上清液，将提取液离心15min，转速4000r/min。 离心后取上清液加入5%活性炭粉，充分搅拌，待色素吸附完后进行真空抽滤，滤液用旋转蒸发器在40℃下蒸发至剩余少量液体。 加入石油醚（体积比1:1）充分振荡30min，静置5min，脱脂。萃取余液用三氯甲烷（体积比2：1）充分振荡30min，萃取滤液在30℃下减压浓缩蒸干，然后用15mL甲醇溶解，制备液经0.45μm过滤器过滤，得浸膏滤液，HPLC外标法测定紫杉醇含量，均分5等份，作好标识，备用。 实验方法 3.1 分离方法 3.1.1 液-液萃取 取浸膏滤液，加入二氯甲烷（浸膏/二氯甲烷的重量比为1:50），充分溶解，再加入与二氯甲烷等量的水。充分混合后静置分层，取有机相，弃水相。有机相再加纯化水萃取，重复三次。讲洗涤后的有机相减压浓缩蒸出二氯甲烷，所得固相浓缩物溶解于甲醇中，用HPLC作定量分析紫杉醇含量。 3.1.2 固相萃取 固相萃取过程包括四个步骤，即固定相活化、样品上柱、淋洗、样品的洗脱。流速稳定在5-8mL/min。 固定相活化：取乙酸乙酯10mL加入柱中，抽空。依次加入甲醇10mL和0.01mol/L(pH=5.0）的乙酸铵缓冲液10mL(乙酸铵水溶液），将页面维持在胶层上1-2mm。 上样及淋洗：讲样品溶于80%-90%的甲醇乙酸铵溶液中，取0.5mL加入柱中，抽空。依次用0.01mol/L的乙酸铵溶液于10mL、50%的甲醇乙酸铵溶液淋洗，抽空。 紫杉醇的洗脱：在淋洗好的柱子中加入80%的甲醇乙酸铵溶液10 mL,收集洗脱液，减压蒸干。从洗脱液蒸干所得的固体物中取样，溶解于甲醇，作HPLC定性定量分析。 3.1.3 硅胶柱层析 硅胶用三氯甲烷浸泡，超声波脱气5min，重力沉降法装柱（15mm*260mm），用三氯甲烷充分析出硅胶中的杂质至柱床透明。样品溶解于三氯甲烷后上柱，再用三氯甲烷充分洗去未被吸附的杂质，然后用3:97（V/V)的甲醇：三氯甲烷进一步洗脱，收集洗脱峰，HPLC测定紫杉醇的纯度。柱层析过程在常温常压下操作。 3.1.4 氧化铝柱层析 甲醇、三氯甲烷用分子筛脱水，层析用氧化铝190℃真空干燥6h后，用脱水三氯甲烷浸泡，超声波脱气5min，装成15mm*260mm的层析柱。清洗柱后上样，用三氯甲烷洗去未被吸附的杂质，再用1%(ψ)的甲醇、三氯甲烷淋洗，最后用5%的甲醇溶液洗脱出紫杉醇，HPLC测定其纯度。柱层析过程在常温常压下操作。 3.1.5 制备薄层层析 用GF254硅胶自制100mm*200mm层析薄板，105℃活化0.5h，样品用甲醇溶解，配成10mg/mL的溶液。毛细管点样，成线状，每班点样量在2mg左右。在对照版中点标准品和样品，用氯仿-甲醇（95:5）展开，254nm紫外光下确定紫杉醇的Rf值。切割并收集制备板上的紫杉醇带，用甲醇洗脱下硅胶上吸附的紫杉醇，HPLC测定其纯度。 3.1.6 超临界萃取法 超临界流体技术（SPF)引入紫杉醇