课件：男性不育的试验室诊断及评价南京医科大学.ppt

４．宫颈粘液穿透试验： 1)?? 体内试验：性交后试验（PCT） 注意事项：①排卵期进行 　 　　　　②禁欲至少2天 　　 　　　③最好在性交后9～24小时进行观察。 诊断标准：正常为宫颈粘液中的活动精子数50个/HP或 A级精子20个／HP 影响因素：①女方的内分泌状况。 　　　　　②宫颈粘液中的白细胞。 　　　　　③阴道pH，7或8.5可导致PCT异常。 ④宫颈结构异常。 ⑤抗精子抗体影响。 ⑥性功能异常,如阴道痉挛。 　　　　　⑦精子质量差。 2)?? 体外试验： ①??? 玻片试验 ②??? 精子－宫颈粘液接触试验 ③??? 毛细管试验: 穿透介质: 人宫颈粘液; 宫颈粘液代用品: 牛宫颈粘液; 含人血清精子营养液; 含牛血清白蛋白精子营养液; 鲜鸡蛋清; ５．精子顶体酶测定（明胶膜法）： 1)?制备5%明胶溶液，吸取100ul均匀涂于载玻片上，自然干燥，4℃湿盒备用，使用前用甲醛－酒精固定液固定60分钟。 2)?精子处理：取液化精液，用PBS稀释至2～4×106个/ml。 3)??涂片：取1滴精液涂于明胶膜上，37℃湿盒2小时。 4)?观察：于相差显微镜下计数有反应精子的百分率及精子的平均反应直径。 5)?正常值：平均反应率≥65%，平均反应直径≥25μm。 6．去透明带仓鼠卵穿透试验 1)?精子准备： ①?精液充分液化 ②?调整精子浓度至10×106个/ml ③?精子获能：取精液0.5ml，5%CO2，95%空气中， 37℃孵育18～24小时，调整精子浓度至4×106/ml。 2)?卵细胞准备： ①?取动情第一天仓鼠，腹腔内注射PMSG 30～40U，48～72 小时后再次注射HCG 30～40U，18小时后输卵管内取卵。 ②?1%透明质酸去除卵丘细胞，0.1%胰蛋白酶去除透明带。 3)?体外受精： 　　将0.1ml精液加至液体石蜡下，再加入20～30个仓鼠卵，培养3小时。 4)?结果观察： 　　　相差镜下见卵丘细胞内膨大的精子头为受精卵，计算受精率，正常为≥10%。 三．精液生化指标检测 1.?????? 酸性磷酸酶测定（ACP） 原理：P－硝基酚磷酸二钠　ACP　→P－硝基酚 测定产生的P－硝基酚含量，推测ACP的活性 正常值：≥200U／一次射精 意义：反映前列腺功能 2.?果糖测定：间苯二酚法 原理：果糖＋间苯二酚　加热　→　红色化合物 测定化合物含量 正常值：0.87～3.95g/L 意义：反映精囊腺功能与精子供能有关 3.?α－糖苷酶测定 原理：麦芽糖　α－糖苷酶　→葡萄糖 测定葡萄糖含量 正常值：35.1～87.7U/ml 意义：反映附睾功能 四．抗精子抗体测定 1.?常用方法： 1)?凝集试验： 原理：大分子或多价抗体如IgM或分泌型IgA可以在精子间形成交链，产生精子凝集，观察。 ①?试管－玻片凝集试验（FramRlin-Dukes）： 　　将待检样本与液化的精液混合后，于３７℃孵育１小时，显微镜下观察，出现３条以上精子头－头、尾－尾或头－尾连接即为凝集，观察１０个视野，５个以上出现凝集即为阳性。 ②?圆盘凝集试验（Friberg） ③?凝胶凝集试验（Kibrick） 缺点：假阳性高 2)?精子制动试验（Isojima）： 原理：在补体参与下，精子表面的抗精子抗体可抑制精子的运动能力。 缺点：敏感性差，IgA的作用常测不出，吸附于精子头部的AsAb作用也常常测不出。 3)?直接免疫荧光试验： 原理：用荧光素标记抗人免疫球蛋白抗体与精子混合后，如精子表面有抗体，则标记的二抗吸附于精子表面，出现荧光。 优缺点：方法敏感，假阴性少，且可确定吸附部位，但假阳性多。 4)?免疫珠试验： 原理：将聚丙烯珠与兔抗人免疫球蛋白相连，如精子表面有抗精子抗体，则免疫珠与精子表面吸附，光镜下即可观察到，计数吸附在免疫珠上的活动精子数，计算百分比，且可确定吸附部位。 优缺点：结果可靠，且可进行抗体分类和定位，但价格较贵。 5）混合抗球蛋白抗体试验（MAR试验）： 原理：将精液与包被了IgG或IgA的乳胶颗粒或红细胞混合，在加入二抗，颗粒与活动精子间形成混合凝集预示精子表面存在IgG或IgA. 6)?酶联免疫吸附试验（ELISA）