ELISA原理及操作注意事项.pdfVIP

ELISA 知识简介 广西中医药科学实验中心 张玲 办公室电话：3946492 ELISA 的发展历程 ELISA 的原理 ELISA 的类型 ELISA的试剂准备 ELISA操作注意事项（视频） 一、ELISA 的发展历程  免疫酶标记技术是继免疫荧光抗体技术和放射免疫 分析之后发展起来的一大新型的血清学技术。  1966年，Nakane和Avrameas 等分别报道用酶代替 荧光素标记抗体，建立了酶标抗体技术（enzyme- labelled antibody technique），用于生物组织中抗 原的定位和鉴定。  1971年，Engvall ，Van Weemen 等报道了酶联免 疫吸附试验，从而建立了酶标抗体的定量检测技术。  20世纪80年代，酶标记抗体检测和鉴定蛋白质分 子的免疫转印技术问世，目前，免疫酶标记技术已 成为免疫诊断、检测和分子生物学研究中应用最广 泛的免疫学方法之一。 二、ELISA 的原理 ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体 的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结 合的一种敏感性很高的实验技术。 基础:抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶 标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保 持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留 其免疫学活性，又保留其酶的活性。 测定时，受检标本与固相载体表面的抗原或抗 体起反应，洗涤加入酶标记抗原或抗体，加入 酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物， 产物的量与标本中受检物质的量直接相关，由 此进行定性或定量分析。 三、ELISA的试剂  ELISA中有三个必要的试剂：免疫吸附剂、结合物 和酶的底物。  （1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附 剂）；  （2）酶标记的抗原或抗体（结合物）；  （3）酶的底物；  （4）阴性对照品和阳性对照品，参考标准品；  （5）结合物及标本的稀释液；  （6）洗涤液；  （7）酶反应终止液（注意防腐蚀） 免疫吸附剂  固相载体--聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性 能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的 免疫学活性。  聚氯乙烯--聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯 乙烯高，但空白值也略高。  良好的ELISA板应该是吸附性能好，空白值低， 孔底透明度高，各板之间、同一板各孔之间、同 一板各孔之间性能相近。  包被用抗原：  天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原三大类。  合成多肽抗原是抗原决定簇的氨基酸序列人工 合成的多肽片段。一般只含有一个抗原决定簇， 纯度高，特异性也高，但由于分子量太小，往 往难于直接吸附于固相上。借助于偶联物与固 相载体的吸附，间接地结合到固相载体表面。 包被用抗体  IgG对聚苯乙烯有强吸附力，其联结发生在Fc段上， 抗体结合点暴露于外。  取材于抗血清或含单克隆抗体的培养液.须除去杂抗 体后才能用于ELISA，以保证试验的特异性。  腹水中单抗的浓度较高，特异性亦较强，因此不需 要作吸收层析处理，直接包被。在某些情况下，用 多种单抗混合包被，可取得更好的效果。 封闭  封闭(blocking)是继包被之后用高浓度的无关 蛋白质溶液再包被的过程。封闭就是让大量不 相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥ELISA 后的步骤中干扰物质的再吸附。  常用封闭剂：0.05%-0.5%的BSA; 10%的小牛血 清或1%明胶;脱脂奶粉,比较价廉，可以高浓度 使用（5%）。  所有的ELISA 固相均需封闭。 结合物用的抗原和抗体  制备结合物时所用纯度较高的IgG，以免在与酶联结 时其他杂蛋白的干扰。最好用层析纯化的抗体，这 样全部酶结合物均具有特异的免疫活性，可以在高 稀释度进行反应，实验结果本底浅淡。在ELISA中用 酶标抗原的模式不多，总的要求是抗原必须是高纯 度的。 酶  纯度高，催化反应的转化率高，专一性强，性质 稳